邓俊耀 张朝晖 秦英键

摘要: 目的:为了解上游法､Percoll梯度离心法､Isolate密度梯度离心法等精子优化处理方 法处理精液的效果。方法:选取120例女性原因引起继发不孕的夫妇,将男方的精液 标 本按处理方法不同随机分4组,即为上游组､Percoll组､Isolate组和对照组,应用指标精 子密度､a+b级活力､正常形态率和绿色荧光精子百分率,对精液处理后的效果进行比较。 结果:上游组､Percoll组和Isolate组,富集的精子a+b级活力､正常形态率､绿色荧光精 子明显高于对照组(P<0.01),Percoll组和Isolate组的精子密度与对照组无明显差异 (P> 0.05),但上游组的精子密度很明显低于对照组(P<0.01);上游组､Percoll组及I sola te组之间比较,富集的精子a+b级活力､正常形态率没有明显差异(P>0.05),但精子 回收 Percoll密度梯度离心法和Isolate密度梯度离心法明显高于上游法(P<0.01),Isolat e密 度梯度离心法富集绿色荧光精子最多,上游法次之,Percoll密度梯度离心法最低。结论: Isolate密度梯度离心法处理精液效果较好。

关键词:精子;优化;评价

中图分类号: R715 文献标识码: A 文章编号: 1008-2409(2009)05-0832-03

Evaluation on the effect of semen processed with three semen optimized methods/D ENG Jun-yao, ZHANG Chao hui, QIN Ying jian∥Laboratory of Reproductive MedicalCenter, Hospital of Guilin Women and Children, Guilin 541000, China

Abstract: Objective: To investigate the effect of semen processedwith Swim up m ethod,Percoll gradient centrifugation method, Isolate density gradient centrifug ation method. Methods: 120 cases of female seco ndary infertility in couples were investigated. The male's semen specimens by th e different treatme nt method were randomly divided into four groups,they were Swim up group, Percol l group, Isolate group and the control group. The parameter s with semen conventional analysis and the percentage of green fluorescent spermwith AO Fluorescence staining were compared. Results: Swim up group, Percoll g roup and Isolat e group concentrated sperm with the a + b class dynamic, the rate of normal formand the rate of green fluorescent sperm were significantly higher than that ofthe con trol group(P<0.01). The sperm density showed no obvious difference in Per coll group a nd Isolate group compared with the control group(P>0.05). However, the sper m de nsity of Swim up group was significantly lower than that of the control group( P<0.01) ,the sperm a + b class dynamic and the rate of normal form showed no obvious di fferen ce between Swim up group and Percoll group and Isolate group(P>0.05). Ho weve r, the sperm density of Percoll group and Isolate group was significantly higherthan that of Swim up group(P<0.01). The rate of green fluorescent spermof Isolate gro up was the highest among Swim up group, Percoll group and Isolate group. Conclusion: T heeffect of semen processed with Isolate density gradient centrifugation method w as better in three methods.

Key words: sperm; optimization; evaluation

精子优化处理是辅助生殖技术治疗中的常规步骤,目的是富集足够数量具有高活力､正常形 态和正常功能的精子。常用于精子优化处理方法有上游法､Percoll梯度离心法､Isolate密 度梯度离心法等,为了选择比较适合于辅助生殖技术治疗的精液处理方法,笔者对这3种优 化处理方法处理精液后的效果进行了评价,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验对象和标本采集

标本选自2008年6~12月份,120例女性原因引起继发不孕的夫 妇,男方年龄在24~40岁,禁欲3~5d,用手淫法取精,将精液收集入无菌无毒容器内,置 37℃(5%CO2)培养箱内液化。

1.2 实验仪器和试剂

无菌操作台(苏州佳宝净化公司),TDL-5Z-B型离心机(湖南星科公司),普 通 显微镜和荧光显微镜(日本OLYMPUS);洗精液(ART-1006),平衡液(ART-1020),Isolat e精 子分离液(40%,80%二氧化硅胶体液组成上､下层,美国IrvineScientific公司),Percoll 精子分离液(40%,80%聚乙烯吡咯烷酮液组成上､下层, 上海晶天生物科技有限公司),吖啶 橙(AO)荧光染液100ml(自配:0.06g/L吖啶橙,37mmol/L 枸橼酸,126mmol/L Na2HPO4 ;1mmol/L EDTA,0.15mol/L NaCl,pH6.0)。

1.3 实验分组

对120例标本随机分为4组,每组30例,对照组(不做特殊处理),上游组( 即上游法处理组),Percoll组(即Percoll密度梯度离心法处理组),Isolate组(即Isola te密度梯度离心法处理组)。

1.4 精子处理方法

①上游法:取液化精液2ml与4ml洗精液(ART-1006)混匀,300g离心15min ,留管底精子团,再用2ml洗精液(ART-1006)混匀,300g离心10min,去除上清液后,留底 部沉 淀精子,加入1.0ml平衡液(ART-1020),倾斜45度角,置CO2培养箱孵育45min,待精子充 分上游后, 吸取上层含精子的悬液0.5ml于无菌试管中。②Isolate密度梯度离心法:取2.0ml 40% Is olate(上层)加入锥形离心管内,然后用无菌巴斯德吸管垂直沿管底缓慢加入2.0ml 80% Isol ate(下层),使两液层交界处可见清晰分界面,最上层加入待处理精液2.0ml,离心和精子收集 与上游法相同。③Percoll梯度离心法:离心管底层加含80% Percoll,中层加含40% Percoll, 上层加入2.0ml精液,方法同Isolate法。

1.5 精液分析方法

将已处理后的精子悬液(对照组取精子原液)充分混匀,采用WHO推荐的 精液常规分析标准方法[1]进行精液分析,主要观察指标精子密度､a+b级活力､正 常形态率。

1.6 AO荧光染色方法

取已处理后的精子悬液(对照组取精子原液)10μl于载玻片上制成薄 层精液膜,无水乙醇固定30min,干燥后加AO染液3滴,染色10min,荧光显微镜490nm观察500条 精子。由于AO与结构完整的双股DNA结合发绿色荧光,则与去螺旋化或变性断裂的单股DNA结 合呈红色,正在变性的DNA显黄光或橙光,计数绿色荧光精子百分率(下称绿色荧光精子率 )。

1.7 数据处理

采用SPSS 11.0统计软件处理数据,用方差和q值进行比较分析。

2 结果

对照组与3处理组精子密度､a+b级活力､正常形态率及绿色荧光精子率的结果见表 1。

3 讨论

常规的精液分析能够从精子密度､精子活力和精子形态等方面反映精液处理后的质量,但是 其在精子功能的评价方面价值是有限的,不能直接反映精子受精能力和对胚胎发育的影响。 近年来的研究表明精子DNA的完整性与精子活力､精子形态及精子功能有显著相关性,并且 精子DNA损伤可以影响受精比率､胚细胞发育和妊娠概率[2],因此,本次评价优化 处理法处 理精液的效果除了用精液常规外,还增加了能反┯尘子狣NA损伤情况的AO荧光染色法。 上游 组､Percoll组和Isolate组与对照组比较,处理后的精子的a+b级活力､正常形态率､绿色 荧光精子率均明显增加,说明3种精子优化处理法富集高活力､正常形态和正常功能的精子 有明显效果;Percoll组和Isolate组的精子密度与对照组无明显差异,但上游组的精子密度 很明显低于对照组,这提示上游法不能用于精子少或弱的精液处理。上游组､Percoll组和I solate组3组之间相互比较中,3组富集的精子的a+b级活力､正常形态率无明显差别,Per coll组和Isolate组的精子密度也无明显差异,但Percoll组和Isolate组的精子密度明显高 于 上游组,说明Percoll密度梯度离心法和Isolate密度梯度离心法处理精液回收精子优于上游 法;而绿色荧光精子率各组之间都有明显差异,其中Isolate组相对最高,上游组相对次之 ,Percoll组相对最低,也就是说对精子DNA的损伤情况,Isolate密度梯度离心法相对最低 ,上游法相对次之,Percoll密度梯度离心法相对最高。Isolate密度梯度离心法处理精液一 方面可能是Isolate精子分离液是一种非连续液态过滤膜,为二氧化硅以共价键形式交错联 结于Hepes-HTF,是经特殊处理的悬浮胶体密度梯度介质,可有效减少细胞污染,与待分离 精子不发生反应,不易使顶体膜蛋白失活[3],具有保护精子DNA结构免受损伤作用 ,另一方 面可能是Isolate所含有的二氧化硅胶体兼作支持体与分子筛的作用[4],对离心力 有缓冲作 用,使对精子潜在的氧化损伤降至最低;上游法处理精液可能是去除了精浆,由于精浆含有 具有保护精子功能的主要抗氧化物质,随着精浆的去除会造成精子的氧化应激损伤,增加DN A断裂概率[5],加之精子在培养液中离心,由于人精子顶体部含有大量不饱和脂肪 酸,并且 缺乏抗氧化机制,处理精液时较大的离心力可增加精子产生过多氧自由基(ROS)而损伤精子功 能,特别是促使精子的DNA 的氧化变性[6,7]。Percoll密度梯度离心法处理精液, 除了上游 法所提到的可造成精子DNA损伤因素外,还可能有由于Percoll中含有聚乙烯吡咯烷酮在离心 过程中可加速精子膜过氧化反应导致DNA完好性受损[7]的因素。由此可以看出,造 成精子D NA损伤的因素,Percoll密度梯度离心法相对最多,上游法相对次之,Isolate密度梯度离心 法相对最少,对精子DNA的损伤情况,理应是Isolate密度梯度离心法相对最低,上游法相对 次之,Percoll密度梯度离心法相对最高。由于Isolate密度梯度离心法处理后精子DNA损伤 最小,其精子密度､a+b级活力及正常形态率均能达到辅助生殖技术治疗要求,因此,笔者 认为Isolate密度梯度离心法处理精液效果较好,在辅助生殖技术治疗中选择该法处理精液 比较适合。

参考文献:

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(收稿日期: 2009-05-02)

[责任编辑 王慧瑾 邓德灵]