陈军宁 尹友生 李小励 韦家智 邓一岚 苏 珂

摘要: 目的:探讨白细胞介素-6(IL-6)基因启动子-572 C/G多态性各等位基因及基因 型在2型糖尿病肾病患者中的分布频率,并分析其基因型与2型糖尿病肾病的相关性。方法: 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测183例2型糖尿病肾病患者 ( 其中91例伴糖尿病肾病)及105例正常对照组IL-6基因多态性,包括IL-6基因启动子- 5 72C/G位点,同时采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-6水平。结果:糖尿病肾病 组 IL-6血清水平显著高于糖尿病不伴肾病组和对照组(P<0.01),IL-6基因多态性在两 组人群 中的分布差异存在显著性差异(P<0.05),等位基因频率的相对风险分析发现,G等位 基因携带 者患糖尿病肾病的风险是C等位基因的1.618倍(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418), 携带G 等位基因的糖尿病肾病患者IL-6血清水平显著高于不携带者(361.71±93.42 pg/ml VS343 .03±86.54 pg/ml, P<0.05)。结论:IL-6基因启动子-572 C/G多态性与糖尿病 肾病的 发病具有相关性,其中G等位基因可能是糖尿病肾病发病的遗传易感基因,携带G等位基因的 个体可能通过促进IL-6的高度表达进而增加2型糖尿病肾病的发病风险。

关键词:白细胞介素-6; 糖尿病肾病;基因型

中图分类号: R587.1 文献标识码: A 文章编号: 1008-2409(2009)05-0801-04

The genotype ofIL-6 gene in patients with type 2 diabetic nephropathy/CHEN Ju n-ning, YIN You-sheng, LI Xiao-li,et al.∥Department of Emergency, The Affil iated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, China

Abstract:Objective: To study the relationship the allele frequencies andgenotype distribution of interleukin(IL-6)gene promoter -572C/G polymorphismi n Chinese patients with type 2 diabetes mellitus and diabetic nephropathy(DN),A nd analyze association the serum levels and genotype of IL-6 with type 2 diab e tic nephropathy.Methods: The IL-6 gene promoter -572C/G polymorphism were det e cted by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR - RFLP)analysis among 183 patients with type 2 diabetes mellitus and 105 healthycontrols. The serum level of IL-6 was determined by enzyme-linked immunos or bent assay(ELISA). Results: The diabetic nephropathy group showed significantlyhigher serum levels of IL-6 than that of control group(P<0.01). There was s ignificant di fference in frequencies of allele and genotype in -572C/G polymorphism between t ype 2 diabetic nephropathy group and control groups, respectively. The relativerisk suffered from type 2 diabetic nephropathyofGallele was 1.618 times of t he C allele(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418), the serum IL-6 level was signific a ntly higher among carriers of G allele as compared with non-carriers(C allele)( 361.71±93.42 pg/ml VS 343.03±86.54 pg/ml, P<0.05). Conclusion: IL-6 genepromo ter -572C/G polymorphism was associated with type 2 diabetic nephropathy, and Gallele may be a genetic risk factor of type 2 diabetic nephropathy. In which theIL-6 G allele carriers may be increase risk by enhancing the IL-6 expressionin the pathogenesis oftype 2 diabetic nephropathy.

Key words:interleukin-6; diabetic nephropathy; genotype

糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一, 是严重危害中､老年人生命健康的疾病。然其病因和发病机制尚未完全阐明,但细胞因子在 其中的作用越来越受到重视。白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是一种具有多种功 能 的炎症细胞因子,它与血脂代谢紊乱､凝血机制异常､动脉粥样硬化形成等糖尿病肾病危险 因素密切相关。IL-6基因存在着基因变异及基因多态性,这种基因多态性与多种疾病存在 相 关性[1-3],与糖尿病肾病是否相关,文献报道较少[4,5]。为此, 笔者应用聚合酶链反 应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,研究IL-6基因启动子-572 C/G多态性及血 清水 平与糖尿病肾病的关系,阐明基因型与表型之间的联系,为认识糖尿病肾病的发病机制提供 一定的实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

1.1.1 2型糖尿病(T2DM)组 共183例,男82例,女101例;平均年龄( 52.7±10.1)岁。均符 合1997年WHO糖尿病诊断标准及分型标准。分为糖尿病肾病(DN)组91例,男40例,女51例, 年龄(57.59±9.72)岁,平均病程(86.85±79.66)月;入选条件:①至少2 次尿白蛋白排泄 率(UAER)>30 mg/24 h;②尿蛋白定量>0.5g/24 h;③血肌酐>167μmol/ L。有上述条件之 一,并排除其他疾病引起的蛋白尿和肾功能不全。糖尿病不伴肾病(DM)组92例,男42例,女 50例,年龄(56.72±9.98)岁,平均病程(82.15±50.85)月;入选条件为3次UAER<30 mg/24 h。

1.1.2 健康对照(HC)组 共105例,男50例,女55例;年龄(54.27±10. 13)岁,为健康体检 者,排除了糖尿病､高血压､冠心病和肥胖及相应疾病的家族史。以上全部研究对象均来自 广西桂北地区汉族人群,且无血缘关系。

1.2 研究方法

1.2.1 引物设计与合成 参照有关文献设计一对引物[6],由北京 赛百盛有限公司合成。用 于特异性扩增IL-6基因包含-572位点的一段DNA引物序列,上游引物为:5-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3;下游引物为:5-GAGTTTCCTCTGACTC CATCGCAG-3。

1.2.2 人类基因组DNA提取 参照已建立的改良碘化钠法。取全血200μl加 无菌双蒸水100μ l混匀,加6mol/L碘化钠 200μl 颠倒混匀2 min(勿震荡),加等体积氯仿/异戊醇(24:1 ) 混匀,漩涡震荡3 min,15000rpm离心15 min,取上清液加240μl 纯异丙醇混匀,室温(或 4℃)静置15 min,15000rpm离心15 min,弃上清,沉淀用37%异丙醇或70%乙醇洗涤3次,自 然晾干,加50μl TE缓冲液溶解,经紫外分光光度计定量后于-70℃冻存备用。

1.2.3 聚合酶链反应基因扩增 IL-6的PCR扩增反应体系为25μl,其中含 10×PCR Buffer 2 .5μl,2.5mmol/LdNTPs2.0μl,引物P1､P2各20pmol,模板DNA 5.0μl,TaqDNA聚合酶1 .25U,不足体积用灭菌双蒸水补足至25μl。置热循环仪(GeneAmp PCR System 2700型)中94 ℃预 变性5min;再按下列程序循环35次,即94℃变性45s,57℃退火1min,72℃延伸1min; 末次循环后,72℃延伸5min。

1.2.4 扩增产物的限制性酶切 取PCR扩增产物10μl,8U MbiⅠ于37℃酶 切3 h(英国Biolab s公司)酶切IL-6基因-572位点,反应终止后,消化片段在3%琼脂糖凝胶上电泳,EB染色 ,染色后经紫外灯判断结果并拍照。

1.2.5 血脂､脂蛋白及载脂蛋白水平测定 酶法测定血清总胆固醇和甘油 三酯;遮蔽法直接 测定高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C);apoA､apoB用双波长免 疫 透射比浊法测定。以上测定均在日立7060型(日本产)全自动生化分析仪上进行,每次测定均 选用高､中､低3种质控样品进行质控,以上项目检测质控均符合英国RIQAS国际质控标准。

1.2.6 血清IL-6水平的检测 采用酶联免疫吸附实验测定IL-6血清水平 (VIDAS型酶标仪),试剂盒由美国GeneMay公司提供,每次测定均严格按说明书操作。

1.3 统计分析

用SPSS 11.5软件包进行分析。基因型和等位基因频率采用基因直接计数法计算,各组 间 基因型及等位基因频率比较采用χ²检验,并以比值比(OR)及其95%可信区间(CI)表示 相 对风险度。计量资料用(±s)表示,各组间数据的比较依据资料的性质, 用t检验､方差分析。以P<0.05为统计学意义。

2 结果

2.1 IL-6基因型分析

IL-6 基因-572 C/G多态性,PCR扩增产物片段大小为163 bp,根据限 制性内切酶MbiⅠ酶切片段的情况,本实验共发现的基因型有3种,CC型(163bp 1条带), CG型(163 bp,101bp,62bp 3条带),GG型(101bp,62bp 2条带)。

2.2 糖尿病肾病组､糖尿病不伴肾病组与对照组临床资料比较

3组在性别和年龄上进行了 匹配。糖尿病肾病组TC､TG､和IL-6水平均显著高于对照组(P<0.01);SBP(收缩压 )､D BP(舒张压)､HDL-C､LDL-C､apoA､apoB在各组间比较差异无显著性(P>0.05), 见表1。

2.3 糖尿病肾病组､糖尿病不伴肾病组及正常对照组IL-6基因型和等位基因频率分布

糖尿 病肾病组IL-6(-572 C/G)基因CC型､CG型及GG型频率分布与正常对照组及糖尿病不伴肾 病 组比较差异均有显著意义(分别为χ²1=6.235,P<0.05;χ²2=6.528,P< 0.05)。糖尿病肾病组G 等位基因频率为60.4%,亦与正常对照组及糖尿病不伴肾病组分布差异有显著意义(χ²1=5. 530,P<0.05;χ²2=5.862,P<0.05),与对照组比较,携带G等位基因的个体 患糖尿病肾病的 相对风险度增加1.618倍(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418)。而不伴肾病组与正常对照组 相比,其基因型频率和等位基因频率差异均无显著性(P>0.05),见表2。

2.4 糖尿病肾病组和对照组IL-6各基因型间血脂､IL-6血清水平比较

2型糖尿病肾病组和对 照组中CG+GG基因型血清IL-6､UC水平显著高于CC基因型(P<0.05),见表3。

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病常见而又严重的并发症,预后较差,发病机制十分复杂。大量研究 证明,遗传因素､糖与脂质代谢紊乱､血流动力学､细胞因子等“共同土壤”的长期作用是 引起糖尿病肾病发生的主要原因。

正常肾组织表达的某些因子对维持肾脏的结构和功能起着十分重要的作用。病理情况下 ,在某些刺激因素作用下,部分细胞因子使肾小球病理变化加剧,引起肾小球组织结构和功 能的异常[7]。病理方面表现为诱发和加重肾小球增生､肥大,基质蛋白沉积,系 膜区扩展 ,基膜增厚,呈现糖尿病典型的肾小球硬化征。IL-6是一种多功能的细胞因子,由T细胞､ 巨噬细胞､成纤维细胞､上皮细胞自发或诱发产生。IL-6可以通过释放继发性细胞因子或 活 化宿主细胞免疫直接或间接实现其效应,在免疫系统､造血系统､神经系统､肝脏代谢中均 起重要作用。其在糖尿病肾病发病过程中所起的作用已引起人们广泛重视。IL-6可促进T､ β细胞过度激活和扩增,加速细胞凋亡,促进胰岛β细胞的破坏[8,9],促进肾脏 系膜增殖 。由此可见,IL-6可通过多途径调节免疫细胞功能,造成胰岛及肾脏病理损伤。IL-6 基 因 位于第7号染色体短臂上,含有5个外显子和4个内含子,在基因启动子区存在-572C/G多态性 ,这种基因多态性可影响IL-6基因转录和表达,并影响IL-6相关疾病的发生､发展和转归 。 由于IL-6在糖尿病肾病发病中有重要作用,IL-6基因与糖尿病肾病关系也得到人们的关注 , 但IL-6基因启动子区-572C/G多态性与糖尿病肾病之间是否存在相关性,是否通过影响血脂 代谢､IL-6的表达而影响糖尿病肾病的病程等等,目前尚不清楚。为┟魅藩狪L-6基因多 态性与 糖尿病肾病的关系,笔者通过对91例糖尿病肾病患者及92例糖尿病不伴肾病患者和105名正 常人IL-6基因多态性分析,发现糖尿病肾病患者IL-6基因-572C/G多态性分布与糖尿病不 伴 肾病组和正常人比较差异具有显著性(P<0.05),其中携带G等位基因个体患糖尿病肾 病的 风险约是C等位基因的1.618倍(OR=1.618,95%CI:1.082~2.418), 提示G等位基因可能是 糖尿病肾病的危险因素之一。为了进一步探讨IL-6基因多态性与其血清水平的关系,笔者 检 测了糖尿病肾病患者及糖尿病不伴肾病患者和健康对照者IL-6血清水平,结果发现糖尿病 肾 病患者及糖尿病不伴肾病患者IL-6血清水平显著高于健康对照者。同时笔者发现IL-6 基 因 -572C/G多态性可影响其血清水平,携带G基因型的糖尿病肾病患者血清IL-6水平显著高于 不 携带者(P<0.05),故认为:在病理条件下,携带G基因型的个体可促进IL-6的高度表 达而增加糖尿病肾病的发病风险。

综上所述,糖尿病肾病是一种多因素参与的常见病,除环境因素影响之外,遗传因素 在其中也起着更为重要的作用,通过研究发现,IL-6基因启动子区-572C/G多 态 性与2型糖尿病肾病具有相关性,其中G等位基因可能是2型糖尿病肾病的遗传易感基因,携 带G等位基因的个体可促进血清TC､IL-6的高度表达进而增加2型糖尿病肾病的发病风险。 但IL-6基因多态性在2型糖尿病肾病发病中的确切机制尚不清楚,有待进一步研究。

参考文献:

[1] GEORGES J L,LOUKACI V,POIRIER O,et al.Interleukin-6 gene po lymorphism andsusceptibility to myocardial infarction:the ECTIM study[J]. J Mol Med, 2001,79:300-305.

[2] OTA N,NAKAJIMA T,NAKAZAWA I,et al.A nucleotide variant in th e promoter re gion of the interleukin-6 gene associated with decreased bone mineral density[ J]. J Hum Genet, 2001, 46:267-272.

[3] NAVARRO J F,MORA C.Role of inflammation in diabetic complic ation[J]. Nephrol Dial Transplant, 2005,20:2601-2604.

[4] 黎国伟.细胞因子与糖尿病肾病[J].国外医学:内科学分册,2004,31 (8):334-338.

[5] 关欣,郑红光.细胞因子在糖尿病肾病发病中的作用[J].中国实用内科 杂志,2005,25(3):268.

[6] BRULL D J,MONTGOMERY H E,SANDERS J,et al.Interleukin-6 gene-174g>c and-57 2g>c promoter polymorphisms are strong predictors of plasma interleukin-6 level safter coronary artery bypass ﹕urgery[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2 001, 21:1458-1463.

[7] 秦文敬.糖尿病肾病患者与相关细胞因子水平的变化[J].放 射免疫杂志,2005,18(3):190-191.

[8] KAWAMOTO S,NITTA Y,TASHIRO F,et al.Suppression of Thl cell a ctivation andprevention of autoimmune diabetes in NOD mice by local expression of riral I[ J].Immunol,2002,13(5):685-694.

[9] JULA B Z,HECTOR F D.Vitamin D and autoimmune diabetes[J] . J Cell Biochem, 2003,88(2):216-222.

(收稿日期: 2009-08-02)

[责任编辑 王慧瑾 邓德灵]