王晓勋李瑞明 陈 敏

•论 著•

等位基因座D21S11稀有等位基因32.3的确认

王晓勋★李瑞明 陈 敏

目的确证在一例单亲亲权鉴定中所发现的在D21S11等位基因座出现稀有的分型标准物外等位基因。方法为了解该稀有的分型标准物外等位基因的确切分型、复合序列结构、及其最小等位基因频率，设计分子生物学实验，经过PCR，克隆测序显示该稀有等位基因是D21S11基因座的稀有等位基因32.3。结果对稀有等位基因32.3的结构和频率进行分析，测序分析显示拟父和孩子的D21S11基因座的等位基因32.3的核苷酸序列结构相同，复合序列为[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCT A]2TCCATA[TCTA]11。结论稀有等位基因32.3频率较低，在亲权鉴定中会增加此基因座的拟然比率（父权指数），从而提高亲权鉴定的非排除结论的概率，在个体识别鉴定中具有重要的意义。

等位基因座；等位基因；似然比率；父权指数(PI)

等位基因座的稀有等位基因是等位基因座中发生频率稀少的一类等位基因，各个稀有等位基因发生的频率不同，复合核心序列不同，在亲权鉴定，同胞鉴定和个体识别中，两个个体和同一个体同时出现发生频率很低的稀有等位基因，可有效的增加亲权、同胞、个体的认定几率。一般认为稀有等位基因是由于重复序列插入、缺失所形成的复合结构，其复合序列结构框为稀有等位基因的命名提供了实验序列的支持。等位基因座D21S11的稀有等位基因32.3在STRbase数据库Variant Allele Reports一直未见报道，目前我们已经将基因座D21S11的稀有等位基因32.3的相关数据递送到STRbase数据库，并被其接受。在STRbase数 据 库Sequence Information（annotated）中许多其它类型的稀有等位基因结构已经确认，但未见等位基因座D21S11的稀有等位基因32.3复合结构的报道，本文利用分子生物学实验得到基因座D21S11的稀有等位基因32.3复合基因序列结构框，填补了该等位基因座稀有等位基因32.3的序列结构及其最小等位基因频率。

1 材料和方法

1.1 样本提取，单亲双联体家系案例一例

采用chelex-100树脂提取全血样本DNA的方法：采集1μL新鲜血液样本，混匀到1 mL配制1×TE缓冲液中，室温放置10 min，8000 r/min离心5 min，去掉上清后，加入5% chelex-100（Bio-Rad）350μL，混匀。100℃ 煮沸10 min，放置过夜后，采用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，沉淀溶解的DNA用于核酸定量和PCR扩增。

1.2 STR等位基因的检测

采用美国ABI 公司Identifiler试剂盒进行分型。按试剂盒说明书进行操作，依据STRbase Core Loci数据合成引物，序列引物如下：5'-ATATGTGAGTCAATTCCCAAG-3'；5'-TGTATTAGTCAATGTTCTCCAG-3'。扩增D21S11等位基因，分别得到两人的D21S11等位基因分型。

PCR试剂：Promega PCR Master Mix 25 μL，Taq酶2μL，处理的标本上清10μL，去离子水13μL，混匀。PE9600基因扩增仪进行以下设置：94℃ 3 min，94℃ 45 s，58℃ 45 s，72℃ 1 min，共32个循环，72℃15 min[1]。

PCR产物电泳：琼脂糖凝胶电泳。鉴定PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）电泳，切胶分离，拟父分离短片段，孩子分离长片段，回收得到DNA，定量后用于TA克隆。

1.3 D21S11克隆

加入pGEM-T载体和回收定量的PCR产物、T4连接酶、连接Buffer，16℃过夜，转化感受态大肠杆菌DH5α进行蓝白斑筛选，得到阳性克隆菌，PCR鉴定插入情况，得到插入目的片段的克隆。

1.4 D21S11克隆片段测序

克隆菌直接提取DNA，按照ABI BigDye3.1测序试剂盒说明书进行操作，使用M13通用测序引物，序列如下：5'-GTTTTCCCAGTCACGAC-3'；5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'。Hi-Di甲酰胺处理变单链，再用ABI310测序仪进行测序分析。对得到的基因座D21S11的等位基因各核酸序列进行多序列比较，所用软件为DNAMAN v6.0。

1.5 实验仪器

Nanodrop2000核酸蛋白检测仪，ABI PE-9600基因扩增仪，ABI 310基因测序仪，eppendorf centrifuge 5415R离心机，ThermStat plus加热模块，Bio-rad PowerPac Basic电泳仪。

2 结果

2.1 两份标本D21S11等位基因座分型结果

单亲（拟父和孩子）identi fi ler STR基因座D21S11分型结果如图1，从上而下分别是500 LIZ ladder，拟父和孩子的D21S11等位基因分型结果。拟父和孩子均出现Off ladder条带，提示在此基因座中出现稀有等位基因，根据产物长度219.06 bp和218.97 bp，比较ladder后初步认定此稀有等位基因为基因座D21S11的32.3。OL显示此等位基因为稀有等位基因，是拟父遗传给孩子的。

2.2 PCR扩增两标本D21S11等位基因座电泳结果

利用STRbase提供的序列合成引物，对拟父和孩子D21S11等位基因座进行扩增，结果如图2。被扩增的目的基因D21S11 OL32.3的长度为231 bp。D21S11 33.2的扩增长度是234 bp。Marker为100～1000 bp（梯度为100 bp）的PCR Marker。由于琼脂糖凝胶电泳的分辨率问题，孩子和拟父的PCR扩增产物的结果在琼脂糖凝胶电泳中可以看到条带，但差别不明显。

2.3 基因座D21S11的OL等位基因测序结果

PCR产物克隆到T载体后，利用M13通用引物测序的结果如图3所示，图A为D21S11等位基因座的测序结果（即OL复合结构序列）；图B为D21S11基因座等位基因33.2的测序结果（此等位基因为常见分型标准内的等位基因，在STRbase中已经有复合序列和基因分布频率的记录）。结果表明基因座D21S11等位基因33.2的复合序列框正好比该基因座OL复合序列框（32.3）多3 bp的长度，以此来判断此OL条带为基因座D21S11的稀有等位基因32.3。

2.4 染色体STR分型结果

单亲鉴定（拟父和孩子）Idnti fi ler分型结果和每个基因座遗传分型的父权指数（PI）见表1。该稀有等位基因遗传频率采用等位基因最小频率0.0014188[1]计算，当这种稀有等位基因被遗传给后代，其PI值达到176.3668，大大提高了此父权鉴定中累计父权指数（CPI）的值。

2.5 基因座D21S11等位基因的复合序列框

拟父和孩子基因座D21S11所有等位基因的复合序列框见表2。结果表明拟父和孩子基因座D21S11的稀有等位基因32.3的复合序列框的结构完全相同，测序结果判读显示此基因座等位基因29、33.2分别比稀有等位基因分别少15 bp和多3 bp。等位基因座D21S11的等位基因33.2为常见分型标准内的等位基因，在STRbase中已经有复合序列和基因分布频率的记录。

图1 D21S11等位基因座分型结果Figure1 The classi fi cation result of D21S11 locus

图2 D21S11等位基因座电泳结果Figure 2 The electrophoresis result of D21S11 locus

表1 拟父和孩子的等位基因分型结果和每个基因座计算的PI值Table1 The classi fi cation result of the allele gene of parents andchild and calculation the PI value of each gene

图B图3 基因座D21S11的OL等位基因测序结果Figure 3 The sequencing results of OL alleles gene of D21S11 locus

表2 基因座D21S11的等位基因复合序列框Table 2 The alleles gene composite sequence box of D21S11 locus

3 讨论

此单亲鉴定中的拟父和孩子皆在等位基因座D21S11中出现稀有等位基因（OL）。依据STRbase设计的引物，经过PCR、克隆、测序显示此稀有等位基因OL是D21S11等位基因座的一种稀有等位基因32.3。克隆测序分析显示拟父和孩子的D21S11基因座OL32.3的复合核苷酸序列结构相同，长度为231 bp。拟父的D21S11基因座等位基因33.2复合核苷酸序列长度为234 bp。因此可以确定拟父分型结果为OL32.3和33.2，孩子分型结构为29和32.3，其D21S11基因座的等位基因皆通过测序得到等位基因的符合序列框（表2）。OL32.3从拟父传给了孩子。图3A图D21S11（OL）对比B图D21S11 33.2等位基因少3 bp，与图1显示相符合，此D21S11基因座OL等位基因的位点应该被命名为D21S11 32.3。其核心测序结果显示其复合结 构 为 [TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA [TCTA]3TCA [TCTA]2TCCATA[TCTA]11。

依据观察到的发生频率计算此32.3等位基因的最小等位基因频率为0.0014188[1]。在亲权鉴定中，特别是两个个体同时检测出相同基因座具有相同的稀有等位基因时，由于稀有等位基因发生的频率低会增加亲权鉴定中此基因座的拟然比率，从而增加总的拟然比率（父权指数），提高亲权鉴定的非排除结论的概率，特别是拟父和孩子都检测出携带有相同的稀有等位基因。在个体同一认定鉴定中共同具有此稀有等位基因可以增加偶合率，为判断来源来自同一个体也起着相当重要的作用[3]。

一般认为稀有等位基因是由于等位基因突变中核酸的缺失、插入或核苷酸的改变所产生的，属于微变异[1]。并且这种突变后的遗传符合孟德尔遗传规律，可以遗传给后代[2,3]。图1显示此拟父和孩子的D21S11等位基因座等位基因（OL）32.3的长度为219.06 bp（拟父）（ID）和218.97 bp（孩子）（ID），此双亲鉴定中拟父和孩子的等位基因型32.3的核酸复合序列结构是[TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3T CA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11，两核心序列完全相同，未发现序列改变。以此判断此孩子的基因座D21S11稀有等位基因32.3是拟父遗传的可能性是随机男人遗传这种稀有等位基因32.3可能性的176.3668倍，大大提高亲权鉴定中累计复权指数。在表1中得到体现。目前，我们已经把此复合序列框的序列提交给STRbase数据库，以完善前期提交的等位基因分型信息。

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Certi fi cation of rare alleles 32.3 of D21S11 locus

WANG Xiaoxun★, LI Ruiming, CHEN Min
(Hubei University of Medicine Af fi liated Taihe Hospital Biomedical Research Institute, Hubei, Shiyan 442000, China)

Objective To certify the rare alleles (off-ladder allele, OL) found on the D21S11 locus in a case of paternity identi fi cation. Methods In order to understand the exact classi fi cation of this rare allele, the composite sequence structure, and its minimum allele frequency, molecular biology experiments, including PCR, cloned and sequencing methods, were designed to prove D21S11 locus exist rare alleles 32.3. Results The structure and frequency of rare alleles 32.3 was analysised. Sequencing analysis showed that the rare allele 32.3 of D21S11 locus of parent and child had the same nucleotide sequence structure. The composite sequence were [TCTA]6[TCTG]5[TCTA]3TA[TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA[TCTA]11. Conclusion The frequency of rare alleles 32.3 was lower, which will increase the likelihood ratio (paternity index, PI) in the paternity identi fi cation, and improve the non-exclusive probability in the paternity test. And also had important signi fi cance in the identi fi cation of individual.

Loci ; Allele; Likelihood ratio; Paternity index(PI)

湖北医药学院附属太和医院生物医学研究所，湖北，十堰 442000

★通讯作者：王晓勋，E-mail:524910@qq.com