白俊伟 曹桂霞

(1.中国美术学院体育部，浙江 杭州 310002;2.浙江长征职业技术学院体育教研室，浙江 杭州 310023)

规律的有氧运动对大鼠学习记忆能力及海马内CaMKⅡmRNA表达的影响

白俊伟1曹桂霞2

(1.中国美术学院体育部，浙江 杭州 310002;2.浙江长征职业技术学院体育教研室，浙江 杭州 310023)

探讨长期有规律的适宜运动对大鼠空间学习记忆能力的影响，CaMKⅡmRNA的表达，及其在学习记忆中的作用。结论：长期有规律的适宜运动可促进大鼠的空间学习记忆能力，海马内CaMKⅡmRNA表达明显升高，说明CaMKⅡ参与了运动对学习记忆的作用。

有氧运动；Y迷宫；CaMKⅡ；学习记忆

1 引言

过去20年来，对动物和人类的实验研究已证明适宜的运动有利于认知功能的改善，即运动能提高记忆能力，并对受损伤大脑的恢复具有良好的促进作用，以及延缓由于年龄的增长引起的记忆能力衰退。不同强度的运动对动物的学习和记忆的影响是不同的，短时间的急性运动对学习记忆并无显著的影响[1]；大强度的长时间运动或疲劳训练可导致脑结构的微损伤，甚至对学习记忆产生不良影响[2]；只有适宜的长期的有氧运动才会对学习记忆产生良好的作用[3,4]。海马一直被认为是参与学习记忆过程的关键部位,而且海马在运动对学习记忆影响起积极的作用。本实验采用8周规律的有氧运动对大鼠进行训练，观察此种运动模型对大鼠空间学习记忆功能的影响。突触传递效能的重要调节机制，包括长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)，可能是以突触后致密结构(Postsynaptic Density，PSD)为基础的。Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一种钙依赖性蛋白激酶，在PSD中含量约占PSD蛋白总量的30-50%，这种高浓度的存在及其自身磷酸化特性，推测它可能在突触部位起记忆的分子开关作用[5]。本实验拟观察CaMKⅡ在运动对大鼠空间学习记忆功能影响中表达的变化及其意义。

2 实验材料与方法

2.1实验动物分组及行为实验

6周龄雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠28只，体重189.1±6.2g，由上海西普尔-必凯实验动物中心提供。用Y迷宫筛选，筛选方案参照王跃春[6]报道的方法，将筛选出的24只大鼠随机分为安静对照组(C组，n=8)和运动实验组(T组，n=16)，在第8周最后一次训练后，将T组断髓处死，取材。

2.2运动模型

采用改装跑台，对T组大鼠先进行一周(3次)的适应性训练，每次25min，运动速度为13.3m/min。随后对T组大鼠进行8周正式的有氧跑台训练，每周运动5次，训练均安排在每周的周一至周五晚间进行，运动负荷参考相关文献[7]确定，如表1所示。

表1 运动组大鼠的运动负荷

2.3取材

将动物断髓处死后，取头，打开颅腔，取双侧海马组织，置液氮速冻后，-80℃保存，待测。两次取材过程均由固定人员操作。

2.4行为学指标测定——Y迷宫法测试大鼠空间学习记忆能力[6]

第7周对两组动物分别进行学习能力测试，采用随机不休息法：安全区以无规则的顺序变换，开始时，对大鼠所在支臂和与另一支臂通电，动物在电击下逃避至灯光区后，在持续10s为一次测试，然后以动物所在支臂为下次测试的起点进行下一次测试。测试次数固定为20次，当连续10次的测试中有9次正确反应，即认为动物达到学会标准(达标)。第8周进行记忆保持(再现)测试：测试动物学会一周后的记忆效果，方法同样，以达到9/10为标准。

2.5大鼠海马内CaMKⅡmRNA的检测(RT-PCR法)

2.5.1检测试剂

Trizol：美国Invitrogen生命技术公司生产；DEPC 水，DNTP，RNA 酶抑制剂，DTT，TBE，Loading buffer均为上海捷兰生物技术有限公司生产，Taq酶，Oligodt(18) 均为宝生物工程(大连)有限公司生产；M-MLV，为Promega(USA)生产。

2.5.2总RNA抽提

取适量组织，加1ml Trizol，充分匀浆，然后将匀浆液移至1.5ml Eppendorf管，室温放置十分钟，充分裂解组织细胞，期间用1ml移液器反复轻轻吸打组织细胞；加200μl氯仿，充分混匀，15000转离心5-7min；取上清，至1.5ml Eppendorf管加500ul异丙醇，混匀，15000转离心10min；弃上清，用75%乙醇1ml冲洗，高速离心5min；弃上清，RNA沉淀于空气中干燥(2-3min)；将干燥后的RNA溶解于DEPC处理水中；将总RNA作适当稀释后，分光光度计测OD260/OD280的比值，并定量。定量公式：RNA浓度(μg/ml)=OD260值×40×稀释倍数(本实验为400倍)

2.5.3逆转录

引物设计和序列

从Genbank查找所测基因的序列，使用Premier5.0软件进行引物设计,引物由上海赛百胜公司合成。引物序列如下：

CaMKⅡ引物 (扩增片段为307bp)

上游5′-ACACCAAGAAGCTCTCAGCCA-3′

下游5′-TTCGAAGCCAGCAACAGATTC-3′

内参基因(GAPDH)的引物 (扩增片段为440bp)：

GAPDH 上游：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′

下游：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3 ′

PCR反应条件(A程序结束后直接进行B程序)：

A程序(降落PCR)：a.94℃ 2min b.94℃ 30s c.65℃-62℃ 45s d.72℃ 1min

B程序：a.94℃ 30s b.62℃ 45s c.72℃ 1min d.72℃ 6min 注：其中a，b，c，三个步骤持续26个循环。

内参基因(GAPDH)反应条件：a.94℃ 2min b.94℃ 30s c.61℃ 45s d.72℃ 1min e.72℃ 6min其中b，c，d三个步骤持续29个循环。

2.5.4凝胶电泳成像

配制1.5%琼脂糖胶(内含0.5μg/ml溴化乙锭)，电泳电压为120V，时间25min，上样量为13.5μlPCR产物加1.5μl的上样缓冲液。

2.5.5基因表达结果计算

使用天能凝胶电泳成像系统对电泳结果拍照并分析条带净面积，将CaMKⅡ基因条带净面积与内参基因GAPDH条带净面积的比值作为CaMKⅡmRNA的表达水平参数。

2.6数据统计

用SPSS 11.0进行统计学分析计算，数据处理用单因素方差分析，其中P<0.05有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。数据结果用平均数±标准差表示。

3 实验结果

3.18周跑台训练对大鼠Y迷宫测试表现的影响

3.1.1大鼠学习能力测试结果

表2 大鼠学习训练过程正确反应率和达到学会标准所需的平均训练次数

(*表示：T组vs C组P<0.05)

由表2可见，在用Y迷宫对大鼠进行学习训练的过程中，T组大鼠每天的正确反应率均高于C组，而且在第二天和第四天，T组大鼠的正确反应率显著高于C组(P<0.05)。两组大鼠达到学会标准所需的平均次数之间虽不存在显著性差异(p=0.148)，但是T组大鼠达到学会标准所需的次数明显少于C组。

3.1.2大鼠记忆能力测试结果

在学习训练后的第三天，我们对大鼠进行了记忆(再现)测试，T组大鼠的平均正确反应次数与C组相比，T组高于C组，具有极显著性差异(P<0.01)。

表3 大鼠记忆测试平均正确反应次数

(**表示：T组vs C组P<0.01)

3.28周跑台训练对大鼠海马CaMKⅡmRNA表达的影响

表4 跑台训练对大鼠海马CaMKⅡ表达的影响

(*表示：T组vs C组P<0.05)

8周跑台训练之后，T组大鼠海马CaMKⅡmRNA表达的平均值显著高于C组，上调31%(P<0.05)，表明大鼠的学习记忆与CaMKⅡ成正相关。

4 讨论

4.1运动对实验大鼠空间学习记忆能力的影响

Becker[8]用损毁的方法观察不同脑区在空间学习与记忆中的作用，发现只要海马系统完好，大鼠就可精确地完成空间任务，推测大鼠的空间学习与记忆的中枢定位可能在海马。Y迷宫能客观地检测大鼠补动逃避及空间辨别类型的学习与记忆能力，因而成为一种常用的研究学习与记忆的检测方法。本实验结果表明，8周跑台训练后，运动组Y迷宫正确反应率与对照组大鼠相比较，具有显著性差异。表明在8周跑台训练后，大鼠的空间学习记忆能力得到一定的提高。

4.2运动对大鼠脑内CaMKⅡmRNA表达的影响及其机制的推测

CaMKⅡ与学习记忆功能关系密切，它在神经递质的合成与释放、骨架蛋白磷酸化、突触可塑性、基因表达等方面有着重要的生物学作用，是神经信息传导通路中的重要因子[9]。本实验结果表明，经过8周的跑台运动可以使CaMKⅡmRNA的表达量与对照组相比得到显著增高，结果具有显著性差异。该实验结果提示：适宜的运动可以明显促进海马内突触致密组织中CaMKⅡmRNA的表达。因此认为海马内突触致密组织中CaMKⅡ在运动提高学习记忆能力过程中有重要的作用。实验表明，诱发LTP后动物的学习记忆能力加强。CaMKⅡ是神经系统中Ca2+调节信号传导系统的一个主要成员，可通过改变突触可塑性来间接影响学习记忆功能。诱发LTP后CaMKⅡ活性显著升高并且其自身磷酸化增加。Fukunaga等发现诱导LTP后CaMKⅡ活性增加，并至少可以持续1 h以上，而LTP又可使CaMKⅡ长时间维持在自身磷酸化状态，使其非CaM依赖的活性延长[10]。对海马的研究结果表明，使用CaMKⅡ抑制剂或敲除CaMKⅡ基因，可完全抑制海马LTP的诱导，而突触后神经元内给予CaMKⅡ或其激活物Ca2+/CaM能够增强突触传递；在体外培养的海马神经元中亦发现突触前膜的CaMKⅡ在突触可塑性的形成中必不可少[11]。Barria等[10]报道：LTP诱发CaMKⅡ的自身磷酸化使谷氨酸受体的亚基磷酸化是维持LTP所必须的。诱导LTP可使海马CA1区AMPA型谷氨酸受体增加，后者则介导突触的快速传递，在记忆巩固中有着重要作用。LTP的诱导可通过激活CaMKⅡ而导致AMPA-R磷酸化增加。他们还发现：此时加用CaMKⅡ抑制剂KN-62后未影响基础性突触传递，也未影响短时程增强(STP，LTP的前10min)，但使LTP的诱导受阻。表明CaMKⅡ是AMPA-R磷酸化的蛋白激酶。Barria认为，经树突棘NMDA-R的钙离子快速内流，使胞浆内钙离子浓度增加，进而激活CaMKⅡ钙离子依赖性活性，再缓慢激活其非钙依赖性自身磷酸化以及AMPA-R的磷酸化，从而增强AMPA-R的反应性。孙臣友等[12]研究发现，采用游泳等慢性复合性应激致大鼠的学习与记忆能力加强，同时CaMKⅡ在海马CA1区和CA3区的表达增加。通过以上的研究我们可以推测，长期的适宜的运动训练使位于NMDA受体通道内阻止Ca2+内流的Mg2+移开，这样当递质与NMDA受体结合后，通道打开，Ca2+内流，细胞内Ca2+浓度升高，继而能够激活Ca2+/CaM第二信使，Ca2+/CaM激活CaMKⅡ的基因表达，从而通过CaMKⅡ的自身磷酸化使谷氨酸受体的亚基磷酸化增加，从而介导突触的快速传递。CaMKⅡα亚基调节神经突触传递的强度，CaMKⅡβ亚基调节树突形态和突触数量，因此认为海马内突触致密组织中CaMKⅡ在运动提高学习记忆能力过程中有重要的作用，从而保证了突触信号传递的有效进行，学习记忆能力得到提高。

5 结论

1) 运动组大鼠在8周的跑台训练之后，其与对照组相比Y迷宫成绩具有显著性差异。从一定程度上说运动提高了大鼠的空间学习记忆能力。

2) 8周的跑台训练使运动组大鼠海马中的CaMKⅡmRNA表达量与对照组相比发生显著性变化。

3) 大鼠的空间学习记忆能力的提高可能与CaMKⅡmRNA表达量的增加有关。

[1] 邵邻相,巩菊芳,洪华嫦.急性游泳后小鼠学习记忆和自由基反应的动态观察[J].中国运动医学杂志,2002,21(6):613-616.

[2] 孙国欣,田振军.有氧训练及大强度疲劳训练对小鼠学习记忆能力的影响[J].西安体育学院学报,2002,19(4):613-616.

[3] 徐波,季浏,林龙年，等.游泳训练对大鼠学习记忆和脑内神经递质的影响[J].中国运动医学杂志,2004，23(3):261-265.

[4] Taeko H,Satoru O,Kisou K.Jogging Improved Performance of a Behavioral Branching Task Implications for Prefrontal Activation [J].Neuroscience Res,2004,49 (3):325-337.

[5] Fukungaga K.CaMKII in long-term potentiation[J].Neurochemi int,1996(28):343-350.

[6] 王跃春.Y型电迷宫在大鼠学习记忆功能测试中的合理运用[J].中国行为医学科学,2005(1):69-70.

[7] Bedford TG,Tipion CM,Nilson NC,et a1.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedure[J]．J Appl Physiol，1979，47(6)：1278-1283.

[8] Becker JT,Walker JA,Olton DS.Neuroanatomical bases of special memory [J].Brain Res,1980,20(2):307-320.

[9] 张君,于嘉屏,曹雪涛.钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶-Ⅱ及其抑制剂[J].国外医学临床生物化学与检验学,2002,23(4):237-239.

[10] Barria A,Muller D.Regulatory phosphorylation of AMPA-type glutamate receptors by CaMKⅡduring long-term potentiation[J].Science,1997,276(9):2042-2043.

[11] Ninan I,Arancio O.Presynaptic CaMKⅡis necessary for synaptic plasticity in cultured hippocampal neurons [ J].Neuron,2004,42(1):129-141.

[12] 孙臣友,刘能保,张敏海，等.慢性复合性应激大鼠学习和记忆与海马突触后致密物质CaMKII的表达变化[J].解剖学报,2005，36(1):19-23.

ExpressionofCaMKⅡmRNAintheHippocampusoftheRatastheirSpaitialLearningandMemorywereEnhancedbyRegularAerobicExercise

Bai Junwei1，Cao Guixia2

(1.Department of PE,China Academy of Art,Hangzhou,310002,Zhejiang,China;2.Department of PE,Zhejiang Changzheng Professional&Technical College,Hangzhou,310023,Zhejiang,China)

To investigate the expression and significance of CaMKⅡmRNA in hippocampus of rats whose spatial learning and memory function were enhanced by Regular Aerobic Exercise.Method Adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into the control and the training group.These results suggest that the training may enhance the spatial learning and memory function of the rat and that the expression of CaMKⅡmRNA in rats hippocampus may participate in the mechanism of enhanced learning and memory.

regular aerobic exercise;Y-maze;CaMKⅡ；the learning and memory

2009-03-27；

2009-06-02

白俊伟(1979-)，男，河南洛阳人，硕士，研究方向：运动人体科学。

G804.2

A

1672-1365(2009)06-0056-03