杨青博 梁佳蕊 孟永宏 刘靓 郭玉蓉 邓红

摘要  以泡菜为原料分离和筛选苹果汁中具有优良发酵潜力的乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）菌株，采用形态学、生理学和遗传学对LAB菌株进行鉴定，并评价其在模拟胃肠环境中的生存能力和发酵性能。结果表明：从泡菜中筛选的2株菌株为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei WFC 414）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum WFC 502）；WFC 414和WFC 502在苹果汁中发酵48 h其活菌數分别达到8.81和9.33 log CFU/mL；2种菌株在模拟胃液（2 h）和肠液（4 h）中，其存活率分别达到92.0%、95.0%和80.7%、83.6%。在4 d的乳酸发酵过程中，WFC 414和WFC 502降低了苹果汁中可溶性糖和苹果酸的含量，产生了大量的乳酸（分别为3.48、5.94 mg/mL）。发酵苹果汁挥发性香气成分改变，酯类和醛类减少，醇类、酸类和酮类的含量升高，增加了果汁的甜香、果香、花香味。试验筛选的乳酸菌WFC 414和WFC 502在发酵果汁行业有很好的应用潜力。

关键词  乳酸菌；筛选；发酵；苹果汁；评价

中图分类号  TS201.3  文献标识码  A  文章编号  0517-6611（2024）09-0139-08

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.09.032

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Screening， Identification and Evaluation of Lactic Acid Bacteria WFC 414 and WFC 502 for Apple Juice Fermentation

YANG Qing-bo1， LIANG Jia-rui1， MENG Yong-hong1，2.3 et al

（1. College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062; 2. National Research ＆ Development Center of Apple Processing Technology， Xian， Shaanxi 710119; 3.Engineering Research Center of High Value Utilization of Western China Fruit Resources， Ministry of Education， Xian， Shaanxi 710119）

Abstract  The lactic acid bacteria with excellent fermentation potential were separated and screened for fermented apple juice using pickles as materials in this experiment. These strains were identified with the methods of morphology， physiology and genetics. The fermentation potential and survival ability in a simulated gastrointestinal environment of these strains were evaluated. The experimental results showed that two LAB strains with excellent fermentation potential were Lactobacillus paracasei WFC 414 and Lactobacillus plantarum WFC 502. The viable counts of WFC 414 and WFC 502 in fermented apple juice for 48 h reached 8.81 and 9.33 log CFU/mL respectively， while their survival rates reached 92%， 95%， and 80.7%， 83.6% respectively， in a 2 h simulated gastric fluid and 4 h simulated intestinal fluid. During lactic acid fermentation of 4 d， WFC 414 and WFC 502 reduced the content of soluble sugars and malic acid in apple juice and produced large amounts of lactic acid （3.48 and 5.94 mg/mL respectively）. There was alteration of volatile aroma components in fermentation apple juice， esters and aldehydes were reduced by both strains， while the content of alcohols， acids and ketones was elevated to increase the sweet， fruity， floral aroma of fermented apple fruit juice. These results suggest that WFC 414 and WFC 502 have great potential for application in the fermented juice industry.

Key words  Lactic acid bacteria;Screen;Fermentation;Apple juice;Evaluation

基金項目  国家自然科学基金面上项目（2017YFD0400700）。

作者简介  杨青博（1999—），女，陕西西安人，硕士研究生，研究方向：食品科学。*通信作者，教授，博士，从事苹果加工与生物发酵工程研究。

收稿日期  2023-06-25

微生物发酵是最常用的食品加工保存方法之一［1］，食物在有益微生物（如lactic acid bacteria，LAB）的作用下，含有的糖类、蛋白质、脂类等被分解转化为独特的风味和营养成分［2-3］，其中发酵乳制品酸奶和奶酪等一直广受世界各地消费者的欢迎。但随着人们对乳糖不耐受和高胆固醇危害的认识不断加深，以水果蔬菜等为基础的发酵果蔬汁类产品吸引了消费者和食品研究人员的更多关注［4］。目前乳酸菌（LAB）发酵在果蔬植物发酵中的应用广泛［4］，且LAB 广泛被认为是一种可在机体肠道内定殖的益生菌，被证明具有缓解肥胖，调节肠道菌群平衡，调控认知功能障碍等多种生物活性［5］，因此发酵已发展为一种精心设计的用于制造功能性食品的生物技术。

苹果含有多种生物活性物质，摄入可预防慢性病、癌症和心血管疾病［6］。鲜榨苹果汁（not form concentrate，NFC）最大程度保存了苹果的有效成分（但NFC 保鲜期很短），含有大量的碳水化合物、维生素等营养物质［7］，是 LAB 发酵的优良底物。LAB通过发酵果汁中的碳水化合物产生乳酸，可改善其风味和口感，提高果汁营养和质量，并延长果汁货架期［8-9］。同时，LAB 发酵的苹果汁也可改善巴氏杀菌、蒸煮等加工步骤造成的苹果汁（如浓缩果汁，form concentrate，FC）的不良变化 ［10-11］。但可应用于苹果汁发酵的 LAB 菌株十分有限，因此，筛选出更多适合苹果汁发酵并能在肠道中定殖的LAB菌株，以增加果汁用益生菌，及扩大发酵食品领域是亟待解决的问题。

泡菜是我国传统发酵食品，其主要由蔬菜上自然附着的微生物发酵而成，其菌种复杂多样，营养丰富，更适于食品的发酵［12］。研究也发现，与自然界中的微生物相比，从传统发酵食品中分离出的 LAB 能够使果汁产生更加令人满意的风味，可以对发酵过程进行标准和安全的控制，并稳定产品的质量［13-14］。

笔者以泡菜为原料分离LAB，筛选出在发酵苹果汁时具有高活性和产香能力强的LAB菌株，对其进行生理生化和基因鉴定，并通过对菌株生长活力，在模拟胃肠道环境中的存活率，苹果汁有机酸和可溶性糖含量以及挥发性香气化合物等指标进行分析，评价所选定的菌株发酵苹果汁的性能优劣，为发酵苹果汁专用菌株的规模化生产提供试验依据，进一步为丰富新型发酵果汁领域产品种类及开发健康营养的商业化苹果汁的益生菌类产品提供基础数据。

1  材料与方法

1.1  材料与设备

4种泡菜：购自华润万家超市（品牌为甘肃陇浆源、四川鲜箩、沈阳榆园、沈阳比美味）；红富士苹果：采自陕西省长武县苹果园。试剂：抗坏血酸、甘油、KH2PO4、 H3PO4、 NaCl、乳酸、丙酮酸、柠檬酸、酒石酸、草酸等，购自天津天利公司；3-辛醇、果糖、 葡萄糖、蔗糖、苹果酸等购自阿拉丁；乙腈、甲醇等购自科密欧。生化鉴定管：青岛海博生物公司。MRS 固体培养基、MRS 肉汤：购自北京奥博星公司。试验设备：榨汁机，惠人设备公司；恒温培养箱，培英实验设备有限公司；高速台式离心机，赛默飞仪器公司；高效液相色谱，安捷伦；恒温水浴锅，杜甫仪器厂；气相色谱串联质谱检测器，日本岛津公司。

1.2  试验方法

1.2.1  泡菜中菌株的分离与保存。

分别吸取4种泡菜汁各0.1 mL，稀释后接种于MRS固体培养基上，在37 ℃条件下厌氧培养48 h。挑取不同泡菜固体培养基上的单个菌落各20个，再进行2次划线纯化培养，纯化后的菌株在MRS肉汤中于37 ℃培养24 h得到菌悬液，并置于50%甘油中保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.2  新鲜苹果汁的准备和发酵。

挑选新鲜无病虫害的红富士苹果，将苹果削皮，去核，切成小块，并立即在0.5%抗坏血酸溶液中浸泡15 s，后使用榨汁机榨取苹果汁，将分离掉果渣的果汁再用滤布过滤得到苹果清汁，然后将鲜榨苹果汁进行巴氏杀菌（果汁加热至90 ℃并保持微沸20 s），最后趁热将果汁灌装入已灭菌的玻璃瓶中，加盖后倒扣放置，待其自然冷却至室温即可得到巴氏杀菌的苹果汁［10］（pasteurized apple juice，PAJ）。

将“1.2.1”中活化后的菌悬液以 6 000 r/min于4 ℃离心5 min，去上清，并用生理盐水洗涤菌体2次后等体积重悬。再以 1%（v/v）的接种量接种到巴PAJ中，使发酵前的果汁中活菌数约为6 log CFU/mL，在37 ℃下厌氧发酵48 h，可得到发酵苹果汁（fermented apple juice，FAJ）［9，14］。

1.2.3  菌株的筛选。

初筛采用感官鉴评法对FAJ进行嗅闻，去除发酵后香气不明显和产生明显不愉快气味的菌株进行［15］。然后用无菌生理盐水的标准连续稀释法对苹果汁发酵前后的活细胞进行计数。将稀释后的FAJ样品接种在MRS琼脂平板上，在37 ℃培养箱中倒置培养48 h。挑选出发酵过程中活细胞数增加最多和最快的菌株。同时，将FAJ稀释后涂在补充有0.7% CaCO3的MRS琼脂平板上，在37 ℃下倒置培养48 h，观察是否形成溶钙圈（有溶钙圈的菌株被认为有可能是LAB）。20名经过培训的志愿者（10名男性和10名女性）对FAJ的气味感官特性进行嗅闻评估（香气分为果香、甜香、草香、花香和刺鼻），采用9分制（0=无，9=特别强）进行打分，并绘制蜘蛛网图。

1.2.4  菌株的鉴定和进化树构建。

1.2.4.1  生理生化鉴定。①过氧化氢酶活性。将菌株接种到MRS固体培养基上，37 ℃培养48 h，向培养基上的菌落滴加3%过氧化氢溶液，观察一段时间，产生气泡则为阳性反应。②明胶液化。将高压灭菌后的明膠培养基倒入试管中垂直放置凝固，挑取菌株于明胶培养基高层约2/3深度穿刺接种，20 ℃培养7 d。观察到固体培养基液化则为阳性反应。③吲哚试验。将菌落接种于邓亨氏蛋白胨水溶液中，37 ℃培养24～48 h，加入二甲苯2 mL，摇匀后静置片刻，再沿试管壁加入2 mL吲哚试剂，二甲苯下层液体变红则为阳性反应。④硫化氢试验。将菌株穿刺接种于试管中的醋酸铅培养基，37 ℃培养24～48 h，观察到培养基变黑则为阳性反应。

1.2.4.2

糖发酵试验。使用生化鉴定管将每个菌株分离物分别与七叶苷、纤维二糖、甘露醇、果糖、蜜二糖、棉子糖、水杨苷、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖接种，在37 ℃下培养24 h。生化管中由紫色变为黄色表示产生了酸，是一种阳性反应。

1.2.4.3  菌株的DNA鉴定和进化树构建。对筛选出的菌株16S DNA进行提取、扩增和测序，然后通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）的BLAST程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）与储存在BQ GenBank-EMBL上的已注册菌株序列进行比对，确定为同源性大于97%的物种。接着选择相关研究中报道的不同LAB菌株序列，用MEGA X 10.0.2软件绘制系统发育进化树［16］。

52卷9期            杨青博等  苹果汁发酵用乳酸菌WFC 414和WFC502的筛选·鉴定与评价

1.2.5  菌株在模拟胃肠道条件下存活率的测定。

模拟胃液（simulated gastric juice，SGJ）和模拟肠液（simulated intestinal juice，SIJ）按照Moayyedi等［17］的方法制备。将1 g LAB细胞接种到9 mL无菌SGJ和SIJ溶液中，37 ℃下以50 r/min的速度在培养箱中分别培养2和4 h。之后在MRS固体培养基上进行培养计数，并计算存活率。

1.2.6  苹果汁中可溶性糖和有机酸含量的测定。

将PAJ和FAJ样品于12 000 r/min离心2 min，上清液通过0.22 μm聚醚砜膜过滤后使用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）对果汁中可溶性糖和有机酸含量进行测定，根据标准溶液的保留时间和标准曲线进行鉴定和定量。

1.2.7  苹果汁挥发性香气成分的测定。

1.2.7.1  顶空固相微萃取。将5 mL苹果汁样品和2 g NaCl在20 mL顶空瓶中混合，并加入10 μL 3-辛醇标准品（100 mg/L溶于甲醇）作为内标。顶空瓶中加入转子，于50 ℃水浴锅中60 r/min磁力搅拌30 min，再使用手动SPME纤维采样器（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，2 cm）进行萃取，使纤维暴露在顶空瓶中的上部气体中，继续在50 ℃水浴锅中60 r/min磁力搅拌30 min。之后，将取样器立即插入GC注射器，在250 ℃下热解吸3 min。

1.2.7.2  气相色谱-质谱法（GC/MS）分析。挥发性香气物质通过GC/MS仪器分离，仪器配备了DB-WAX毛细管柱（30 cm×250 mm×0.25 μm）。使用氦气（99.999%）作为载气，流速为3 mL/min。气相色谱条件：40 ℃保持3 min，以10 ℃/min的速度升至100 ℃保持5 min，再以4 ℃/min的速度升至230 ℃保持10 min。质谱通过电子电离（EI）模式在70 eV下扫描，得到35～500 m/z 的范围。

1.3  数据处理

所有都进行3组平行试验，数据以平均值（Mean）±标准差（SEM）表示。柱状图和折线图使用 Origin 2021 软件绘制。单因素方差分析（One-way ANOVA）结合多重比较（Tukey 检验），确定组间显著差异。统计数据采用方差分析进行评估，比较试验采用 SPSS 20.0 的邓肯检验进行验证；P<0.05 的值被认为具有统计学意义。

2  结果与分析

2.1  传统泡菜中乳酸菌的分离与筛选

研究表明，通过 LAB 发酵降低pH能够提高果汁的抗菌性，并提供口感柔和的酸味［18］；此外，发酵果汁的香气对最终产品的影响至关重要［19］。因此，应筛选出在发酵苹果汁时具有较强的香气产生能力及较高的活细胞数，以及明显降低pH的菌株。从4种泡菜中共分离出80株细菌。首先根据感官分析对每个菌株的发酵苹果汁气味进行嗅闻，以初筛菌株；其中20个菌株发酵产生了不可接受的气味，17个菌株发酵未产生明显的香气，32个菌株发酵产生较淡的香气，11个菌株发酵后产生强烈的香气。

该试验对具有强产香能力的这11个菌株进行了二次复筛，结果见表1。由表1可知，WFC 414和WFC 502菌株表现出较强的降低pH和活细胞数生长能力，发酵后pH分别为3.97±0.07和3.74±0.05，活菌数分别为（8.81±0.13）和（9.33±0.12）log CFU/mL，且2株菌在添加碳酸钙的培养基中都产生了溶钙圈。

按照“1.2.3”中的方法经过气味感官评价可知（图1），WFC 414和WFC 502具有较为突出的果香、甜香和花香，较淡的草香，无刺鼻味。因此，选定WFC 414和WFC 502这2个株菌作为苹果汁发酵用菌株，并对2个菌株的其他特性进行研究。

2.2  菌株的鑒定和系统发育进化树的构建

2.2.1  菌株形态学、生理生化和糖发酵试验鉴定。

按照“1.2.4”中的方法进行试验，通过革兰氏染色、显微镜观察，发现WFC 414 和 WFC 502 均为革兰氏阳性、无运动性、无芽孢的短杆菌（图2）。2株菌的生化检测与糖发酵试验结果见表2。由表2可知，2株菌均为过氧化氢酶活性阴性，是不液化明胶，不产生吲哚，不产生硫化氢的菌株。

表2显示，WFC 414 和 WFC 502 对七叶苷、纤维二糖、甘露醇、果糖、水杨苷、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和海藻糖都有阳性反应，WFC 502 能发酵蜜二糖和棉子糖，WFC 414 不能。WFC 414 的特性与干酪乳杆菌组的特性相似，干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）和鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）属于干酪乳酸杆菌组，它们有许多共同的特征，其表型特别相似［20］。而WFC 502与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的特性一致。尽管这些鉴定方式可以在物种水平上有效区分菌株，但在遗传水平上的鉴定更加有力［21］。

2.2.2  菌株的 DNA 鉴定和进化树构建。

乳酸菌的微观和生理生化鉴定只能初步确定其与菌种表型特征的相似性，并不意味着基因型的亲缘关系是相近的。试验进一步通过提取和测序得到2菌株的16S rRNA基因部分片段，在NCBI BLASTn中输入2株菌的基因片段进行比对，结果显示，WFC 414（登录号：OP735581）与 L.paracasei序列的同源性高于 98%，WFC 502（登录号：OP735580）与L.plantarum的基因序列有 99%的一致性。用邻接法［16，22］重建的系统发育进化树（图3）显示了这2株菌株的 16S rRNA 基因序列与其他已报道的 LAB 菌株之间的系统发育关系。

通过系统发育进化树的拓扑结构和菌株的相对位置，确定了WFC 414和WFC 502的菌种属性。WFC414与L.paracasei菌种的系统发育支系具有相近的基因型。L.paracasei通常分离自肠道和植物中，并被广泛、商业化地应用于发酵水果、饮料、酸奶等食品中［23］。WFC 502与L.plantarum菌种的系统发育支系的自举值为100；L.plantarum是发酵果汁中常见的LAB，它还被发现有抑制结肠直肠肿瘤和减轻小鼠的氧化应激等作用［24］。总之，根据微观形态、生理生化测试以及系统发育分析，2个筛选菌株WFC 414和WFC 502可以分别确定为L.paracasei和L.plantarum。

2.3  筛选的菌株在模拟胃肠道环境中的存活情况

胃液中的酸会抑制和杀死进入胃中的大多数细菌，能够耐受胃液和胆汁盐中的环境并抵抗酶的消化，是LAB在人体消化系统中生存，在肠道中定殖并发挥其益生菌功能所需要的特性。试验筛选的乳酸菌WFC 414和WFC 502在模拟胃液和肠液中的耐受性结果见图4A、图4B。

图4A显示，当暴露在含有 0.3%胃蛋白酶的低 pH（2.0）的 SGJ 中 2 h 后，WFC 414和WFC 502的相对活力均有所下降。WFC 414的活细胞数在2 h出现了明显下降，WFC 502的活细胞数在1 h明显减少，但在2 h减少不明显。2株菌在SGJ中的不同变化过程可能是由于对酸性条件敏感性的不同，WFC 502比WFC 414更敏感，pH的突然变化使其活细胞数在1 h发生快速下降。

图4B显示，当WFC 414和WFC 502暴露在含有0.2%胰蛋白酶和0.6%胆汁盐的SIJ中4 h后，WFC 414和WFC 502的相对存活率分别为80.7%和83.6%。在SIJ中的前3 h，WFC 414的活细胞数持续下降。然而，WFC 502的活细胞数仅在1 h减少，最后3 h的变化不明显。一些乳酸菌只对低pH条件或胆汁盐条件有很强的耐受性，但在有胃蛋白酶或胰蛋白酶的模拟胃肠环境下存活率较低，这一现象可能是由于酶的存在破坏了细菌细胞，导致其对低pH和胆汁盐敏感［25-26］。一些研究使用谷物纤维或多糖固定和保护细菌细胞免受不利因素的影响［27］，然而，这可能会影响果汁产品的口感和味道。因此，筛选出对胃肠道消化有强抵抗力的 LAB 作为果汁发酵剂至关重要。

由于WFC 414和WFC 502在模拟胃肠道条件下培养后，其存活率很高，试验认为它们具有较好的益生菌潜力。

2.4  发酵苹果汁中可溶性糖和有机酸的变化

果糖、葡萄糖和蔗糖是苹果汁中主要的糖类，它们可以被乳酸菌利用和消耗［28］。经WFC 414 和WFC 502 发酵后，苹果汁中3种糖含量均有所下降，结果见表3。

由表3可知，发酵2 d后，WFC 414、WFC 502使FAJ中的果糖分别减少了5.40、4.94 mg/mL；之后的2 d中WFC 414继续减少了1.81 mg/mL的果糖（而WFC 502不再消耗果糖）。葡萄糖在WFC 414和WFC 502 4 d的发酵过程中一直保持下降趋势，最终减少了7.09 mg/mL（P<0.05）和7.47 mg/mL（P<0.05）。FAJ中的蔗糖含量要比果糖和葡萄糖低得多，其消耗量也很小，发酵4 d后，WFC 414和WFC 502 FAJ中的蔗糖分别降低了2.59和2.36 mg/mL。Jahandideh等［29］在使用LAB发酵蓝莓汁时也观察到类似现象，不同的LAB对可溶性糖的代谢因菌株而异。

苹果酸是苹果汁中最重要的有机酸之一，其向乳酸的转化是LAB发酵过程的标志［30］。由表4可知，未发酵的PAJ中苹果酸浓度为（2.44±0.07） mg/mL，未检测到乳酸。发酵2 d后，观察到WFC 414和WFC 502对苹果酸的消耗高达98%和99%。与此同时，菌株产生的苹果酸酶催化苹果酸产生乳酸，乳酸含量达到（2.63±0.02）和（3.61±0.12） mg/mL；继续发酵2 d后，苹果酸含量不再下降，而乳酸含量继续显著增加到（3.48±0.12）和（5.94±0.10） mg/mL，这表明LAB可能有其他的碳源代谢途径。同时，发酵后生成的乳酸具有其特有的气味，对果汁的香气产生了影响。结合图1分析，WFC 502中较高的乳酸含量可能使其具有更多的果香和草香，而WFC 414中较少的乳酸突出了甜味和花香味。

在PAJ和FAJ中都检测到少量的丙酮酸，其含量变化不大。丙酮酸是三羧酸循环和糖酵解等生物体代谢途径的中间产物，其可以由葡萄糖通过糖酵解途径产生，但也可以通过乳酸发酵途径转化为乳酸［31］，其含量可能呈现动态平衡。FAJ中草酸含量的变化趋势与丙酮酸相似，没有显著性。发酵前后的苹果汁中未检测到柠檬酸和酒石酸，这一结果可能与苹果品种有关。

2.5  发酵苹果汁中挥发性香气成分的变化

果汁中的挥发性香气对消费者评价产品有特定的影响。因此，探究WFC 414和WFC 502发酵对苹果汁香气的改变也是综合评价菌株的方式之一。由表5可知，在PAJ和FAJ中共检测到59种挥发性化合物成分，其中有19种醇类，20种酯类，7种醛类，3种酮类，6种酸类以及4种其他类。

醇类是PAJ和FAJ中最丰富的香气成分之一，醇类能够为果汁赋予高级的香气，并且可以作为其他芳香化合物的良好溶剂，促进香气的保留。PAJ中醇类的种类不多，但含量占总挥发性化合物含量的48.79%。果汁中的1-己醇有助于产生果香和花香；2-甲基-1-丁醇和1-己醇在PAJ中的含量明显高于其他醇类，在发酵后的FAJ中也有不同程度的增加，它们被认为是苹果汁中的关键醇类。

此外，WFC 414发酵产生了大量的乙醇（108.97 μg/L）、6-甲基-5-庚烯-2-醇（72.64 μg/L）和香叶醇（49.10 μg/L）；这种菌株能够将葡萄糖和氨基酸转化为乙醇，在果汁中产生更明显的甜香，香叶醇和芳樟醇的产生使FAJ表现出玫瑰和柑橘的香气。WFC 502发酵提高了反式-2-己烯醇（11.28 μg/L）的含量（具有树叶、核桃和水果香气），Han等［32］的研究中也有类似的结果。2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丁烯-1-醇、1-辛烯-3-醇和1-壬醇在2种发酵的FAJ中都有产生，它们分別具有像葡萄酒、野莓、蘑菇、新鲜和橙子的香味。WFC 414和WFC 502的发酵明显减少了苹果汁中的1，3-辛二醇含量。因此，乳酸菌的发酵促进了醇类的产生，丰富了FAJ的背景香气。

酯类是对苹果汁香气贡献最大的挥发性化合物之一，是果味香气的主要来源。在PAJ中共检测到13种酯类，其中最主要的是2-甲基丁基乙酸酯，这是新鲜苹果汁的香气特征物质，赋予果汁果味和甜味。PAJ中其他突出的酯类（如丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸己酯、乙酸壬酯、2-苯基乙酸乙酯），在WFC 414和WFC 502的发酵过程中几乎完全被消耗。酯类的减少与其自身的挥发性有关，也可能是乳酸菌高酯酶的活性促进了酯的降解，在LAB发酵的杨桃汁和甜瓜汁中也观察到同样现象［33］。除了2-羟基-3-甲基戊酸甲酯（果味和焦糖味）在WFC 414发酵过程中还产生了3种新的酯，即3-羟基己酸乙酯（果味）、异戊酸香叶酯（果味和玫瑰香味）、棕榈酸甲酯（蜡质和鸢尾味）。WFC 502发酵也增加了3种新的酯类，分别为1，2-乙二醇二乙酸酯（花香味和酒精味）、庚基乙酸酯（朗姆酒和梨香味）、乙酸橙花酯（甜味和柑橘味）。

此外，还检测到果汁中的一些萜类和酚类化合物，但WFC 414和WFC 502的发酵都减少了α-法尼烯含量（柑橘味和草药味），并去除了苯酚（带有令人不愉快的塑料和橡胶味）。WFC 414发酵还产生了反式芳樟醇氧化物（呋喃类），增强了FAJ的花香味；WFC 502发酵产生了丁香酚，使FAJ具有丁香和蜂蜜的香味。香气是评价苹果汁的重要指标之一，LAB发酵是丰富苹果汁香气的有效途径，尽管有些化合物浓度阈值很低，它们仍然在发酵过程中影响着苹果汁的香气特征和质量，这还需要进一步深入探讨。试验筛选的乳酸菌WFC 414和WFC 502发酵果汁FAJ比PAJ含有更多的挥发性酸（如2-甲基丁酸、3-甲基戊酸、己酸和辛酸），酸类物质有些会释放出不易被公众接受的气味，但它们也赋予了FAJ独特的微生物发酵的香气［34］。

3  结论

从泡菜中分离并筛选确定了2个在发酵苹果汁中具有令人满意的细胞活力及产生优良香气能力的菌株，经过表型和基因型的鉴定确定2株菌分别为副干酪乳酸杆菌（L.paracasei WFC 414）和植物乳酸杆菌（L.plantarum WFC 502）；这2个菌株在体外模拟的胃肠道环境中均具有较高的存活率。WFC 414 和 WFC 502 发酵降低了苹果汁中的可溶性糖含量（主要是果糖和葡萄糖）；充分代谢了苹果酸，并产生了大量的乳酸。WFC 414 和 WFC 502 发酵也使苹果汁中的挥发性香气成分发生了变化，2菌株都降低了酯类的种类和含量，上调了果汁的甜香、果香、花香和来自醇类、酮类和酸类的独特发酵气味。

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