许峥嵘，任卫东，谷君，张志英，邓文娟，左丽娟

（河北北方学院附属第一医院内分泌科，河北 张家口 075000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病控制不佳导致蛋白尿与肾小球滤过率进行性降低，是糖尿病的严重合并症［1］。随着社会的进步、饮食结构的改变，DN已成为我国终末期肾病的第2位原因。DN的发病机制是DN的研究重点，有助于临床控制DN肾脏损伤。微RNA（mciroRNA，miRNA）可能通过影响肾小管上皮细胞的凋亡参与DN的发展［2］。研究［3］报道，miR-31-5p升高可抑制高糖诱导的人系膜细胞生长、炎症、细胞外积累以及氧化应激。高迁移率族蛋白A1（high mobility group protein A1，HMGA1）在DN中发挥重要作用，可调节DN小鼠肾小管上皮-间充质转化［4］。生物信息学分析显示，miR-31-5p与HMGA1存在结合位点，miR-31-5p/HMGA1可能是调控DN的一个方向。环状RNA（circular RNA，circRNA）主要通过与miRNA竞争性结合调控靶基因发挥作用，并参与DN的进展。circLRP6在DN中表达异常，且生物信息学分析显示circLRP6与miR-31-5p存在结合位点。因此，本研究以高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤模拟体内DN损伤，分析circLRP6对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响，并分析其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

人肾小管上皮细胞HK-2，购自美国ATCC细胞库；白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；HMGA1、Bax、Bcl-2、GAPDH兔抗、羊抗兔IgG二抗，购自英国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组：体外培养HK-2细胞，常规传代，取对数生长期HK-2细胞，分为对照组、高糖组、高糖+si-NC组、高糖+si-circLRP6组、高糖+si-circLRP6+miR-NC组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组、高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC组、高糖+sicircLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组。对照组置于含5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养，其余各组置于含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基内培养，并通过Lipofectamine 2000将相应质粒转染至HK-2细胞内，培养基内培养。

1.2.2 HK-2细胞circLRP6、miR-31-5p、HMGA1mRNA水平检测：采用TRIzol法提取各组细胞中总RNA，反转录后进行cDNA扩增，程序设定为95℃，30 s（预变性）；95℃，5 s（变性），55℃，10 s（退火），72℃，15 s（延伸），共40个循环。采用2-ΔΔCt法分析circLRP6、miR-31-5p、HMGA1mRNA表达情况，以GAPDH作为circLRP6、HMGA1mRNA的内参，以U6作为miR-31-5p的内参。引物序列：circLRP6，正向5’-CAAGATTGA GGCAGGCAGTG-3’，反向5’-GCTCCAGTCAGTCCA GTACA-3’；HMGA1，正向5’-ATGAACTCCGAAGGC CAGCC-3’，反向5’-CCTTCCTAGGTCTGCCTCTTG G-3’；GAPDH，正向5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAA C-3’，反向5’-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’；miR-31-5p，正向5’-CCCTCGAGACATTTGAAAGCCATTA GACT-3’，反向5’-GCGTCGACAGGTTGAGCGAGCG AAG-3’；U6，正向5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG C-3’，反向5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.2.3 细胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量测定：收集各组细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、TNF-α水平；硫代巴比妥酸法检测MDA含量；LDH试剂盒检测LDH活性。

1.2.4 细胞凋亡率的测定：收集各组细胞，胰酶消化后，以5×105/mL的浓度重悬于500 μL 1×膜联蛋白结合缓冲液中，加入Annexin V-FITC（5 μL）和碘化丙啶（10 μL）避光孵育15 min，流式细胞仪观察细胞凋亡情况。

1.2.5 Western blotting检测蛋白水平：用RIPA裂解液裂解各组HK-2细胞后，BCA法测定总蛋白浓度，SDS-PAGE分离并转膜，脱脂牛奶封闭1 h后，加入兔抗GAPDH（1∶5 000）、HMGA1（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）一抗孵育（4℃）过夜，隔日加入羊抗兔二抗（1∶4 000）孵育2 h，用蛋白凝胶成像仪定量分析蛋白含量。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验：Starbase网站（https：//rnasysu.com/encori/）预测miR-31-5p与circ-LRP6、HMGA1的结合位点。构建circLRP6野生型（circLRP6 WT）和突变型质粒（circLRP6 MUT）以及HMGA1野生型（HMGA1 WT）和突变型质粒（HMGA1 MUT），分别与mimic NC、miR-31-5p mimic共转染至HK-2细胞，分为mimic NC+circLRP6 WT组（circLRP6 WT与mimic NC共转染）、miR-31-5p mimic+circLRP6 WT组（circLRP6 WT与miR-31-5p mimic共转染）、mimic NC+circLRP6 MUT组（circLRP6 MUT与mimic NC共转染）、miR-31-5p mimic+circLRP6 MUT组（circ-LRP6 MUT与miR-31-5p mimic共转染）、mimic NC+HMGA1 WT组（HMGA1 WT与mimic NC共转染）、miR-31-5p mimic+HMGA1 WT组（HMGA1 WT与miR-31-5p mimic共转染）、mimic NC+HMGA1 MUT组（HMGA1 MUT与mimic NC共转染）、miR-31-5p mimic+HMGA1 MUT组（HMGA1 MUT与miR-31-5p mimic共转染），48 h后测定荧光素酶活性。实时定量PCR测定沉默si-circ-LRP6后circLRP6与miR-31-5p水平（si-NC组、si-circ-LRP6组），实时定量PCR和Western blotting测定miR-31-5p过表达对HMGA1mRNA和蛋白表达的影响（mimic NC组、miR-31-5p mimic组）。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料用±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circLRP6在高糖诱导的HK-2细胞中的表达

与对照组相比，高糖组HK-2细胞中circLRP6表达水平升高（1.01±0.09和1.97±0.21，P＜0.05）。

2.2 各组HK-2细胞增殖抑制率、炎性细胞因子水平、LDH活性和MDA含量的比较

与对照组相比，高糖组HK-2细胞增殖抑制率、细胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均升高（P＜0.05）；与高糖组相比，高糖+si-circ-LRP6组HK-2细胞增殖抑制率、细胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均降低（P＜0.05）；与高糖+si-circLRP6组相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组HK-2细胞增殖抑制率、细胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均升高（P＜0.05）；与高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组HK-2细胞增殖抑制率、细胞上清液IL-6水平、TNF-α水平、LDH活性、MDA含量均降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组HK-2细胞增殖抑制率、LDH活性、IL-6和TNF-α水平以及MDA含量的比较Tab.1 Inhibition rate of HK-2 cell proliferation；lactate dehydrogenase（LDH）activity；interleukin（IL）-6 and tumor necrosis factor（TNF）-α levels；and malondialdehyde（MDA）content in each group

2.3 各组HK-2细胞凋亡情况

与对照组相比，高糖组HK-2细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）；与高糖组相比，高糖+si-circLRP6组HK-2细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05）；与高糖+si-circLRP6组相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor组HK-2细胞凋亡率、Bax蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低（P＜0.05）；与高糖+si-circ-LRP6+miR-31-5p inhibitor组相比，高糖+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1组HK-2细胞凋亡率、Bax蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高（P＜0.05），见表2、图1。

1，control group；2，high glucose group；3，high glucose+si-NC group；4，high glucose+si-circLRP6 group；5，high glucose+si-circLRP6+miR-NC group；6，high glucose+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor group；7，high glucose+si-circLRP6+miR-31-5p inhibitor+si-NC group；8，high glucose+si-circ-LRP6+miR-31-5p inhibitor+si-HMGA1 group.图1 各组HK-2细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达情况Fig.1 Bax and Bcl-2 protein expression in HK-2 cells of each group

表2 各组HK-2细胞凋亡情况的比较Tab.2 Comparison of apoptosis of HK-2 cells in each group

2.4 miR-31-5p与circLRP6的靶向关系

Starbase网站预测显示，miR-31-5p与circLRP6存在结合位点（图2）。miR-31-5p mimic+circLRP6 WT组荧光素酶活性较mimic NC+circLRP6 WT组低（0.35±0.02和1.02±0.09，P＜0.05），mimic NC+circ-LRP6 MUT组与miR-31-5p mimic+circLRP6 MUT组比较，荧光素酶活性的差异无统计学意义（1.02±0.10和1.03±0.10，P＞0.05）。与si-NC组相比，circLRP6组circLRP6表达降低（0.33±0.04和1.01±0.12，P＜0.05），miR-31-5p表达升高（2.96±0.37和1.02±0.12，P＜0.05）。

图2 Starbase网站预测miR-31-5p与circLRP6结合位点Fig.2 miR-31-5p and circLRP6 binding sites predicted by the Starbase website

2.5 miR-31-5p与HMGA1的靶向关系

Starbase网站预测显示，miR-31-5p与HMGA1存在结合位点（图3）。miR-31-5p mimic+HMGA1 WT组荧光素酶活性较mimic NC+HMGA1 WT组低（0.32±0.05和1.13±0.21，P＜0.05），mimic NC+HMGA1 MUT组与miR-31-5p mimic+HMGA1 MUT组比较，荧光素酶活性的差异无统计学意义（1.10±0.10和1.08±0.19，P＞0.05）。与mimic NC组相比，miR-31-5p mimic组HMGA1mRNA水平（0.40±0.05和1.01±0.12，P＜0.05）和蛋白表达水平（0.37±0.04和0.89±0.11，P＜0.05）降低。见图4。

图3 Starbase网站预测miR-31-5p与HMGA1结合位点Fig.3 miR-31-5p and HMGA1 binding sites predicted by the Starbase website

3 讨论

DN与肾小管病变和肾功能损伤关系密切，肾小管上皮细胞丢失是肾小管病变的原因之一［5］。在糖尿病中，长期的高糖刺激会诱导肾小管上皮细胞损伤，导致肾功能障碍。用高糖处理肾小管上皮细胞能模拟体内高糖诱导的肾小管损伤环境［6］。本研究中，高糖处理后HK-2细胞的增殖抑制率、凋亡率升高，证明成功构建HK-2细胞损伤模型。

circRNA可作为miRNA海绵介导下游基因表达，参与DN的发生、发展。研究［7］报道，circLRP6在高糖诱导的系膜细胞中上调。本研究中，高糖诱导的HK-2细胞中circLRP6水平升高，下调circLRP6表达后，HK-2细胞的增殖抑制率、凋亡率降低，提示circ-LRP6可能为肾小管上皮细胞的有害因子，可能是DN治疗的靶点之一。DN患者中肾小管上皮细胞损伤与炎症和氧化应激有关。炎症在DN的肾小管上皮细胞损伤中占据重要地位，IL-6、TNF-α等炎性因子的产生会进一步诱导细胞凋亡的发生。此外，细胞内氧自由基累积增加时会引发细胞膜脂质过氧化，细胞膜完整性被破坏，细胞内LDH等毒性物质流出，MDA作为脂质过氧化产物可反映细胞氧化应激损伤程度［8］。本研究中，circLRP6沉默可降低HK-2细胞上清液中IL-6、TNF-α、LDH、MDA水平，提示circ-LRP6沉默可能通过抑制氧化应激和炎症反应，减轻高糖诱导的HK-2细胞损伤。

研究［9］显示，miR-31-5p在DN患者体内表达降低。在高糖诱导的足细胞损伤模型中，miR-31-5p低表达［10］。此外，miR-31-5p在高糖诱导的系膜细胞损伤中低表达，上调miR-31-5p表达可抑制高糖诱导的系膜细胞增殖、炎症和氧化应激［5］。以上研究表明，miR-31-5p在DN中发挥保护作用。本研究中，miR-31-5p抑制剂可减弱circLRP6沉默对高糖诱导的HK-2细胞损伤的保护作用，且双荧光素酶报告基因实验证实circLRP6与miR-31-5p存在靶向调控关系，提示circLRP6沉默可能通过上调miR-31-5p表达发挥对HK-2的保护作用。

HMGA1是广泛分布于细胞核内的非组蛋白，广泛调节DNA复制、转录、基因表达调控等［11-12］。研究［13］报道，HMGA1是胰岛素受体基因的重要调节因子，也是2型糖尿病发展的危险因素，在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中，主动脉组织中HMGA1水平显著上调和积累，在体外，高糖会增加HMGA1的表达并促进血管平滑肌细胞增殖。WU等［14］的研究显示，HMGA1在糖尿病小鼠心脏和高糖刺激的心肌细胞中上调，其过表达加速了高糖诱导的心肌细胞炎症和细胞凋亡，并加重了糖尿病小鼠心脏功能障碍，而HMGA1敲低可减轻心肌细胞对高糖诱导的炎症和细胞凋亡的反应。在本研究中，双荧光素酶报告基因实验证实miR-31-5p与HMGA1存在靶向结合，且miR-31-5p过表达可显著降低HMGA1mRNA和蛋白表达，提示circLRP6沉默可能通过miR-31-5p/HMGA1发挥对HK-2的保护作用。下调HMGA1表达恢复了miR-31-5p抑制剂对circLRP6沉默在高糖诱导的HK-2细胞损伤中的逆转作用。

综上所述，沉默circLRP6可能通过上调miR-31-5p、抑制HMGA1表达对高糖诱导的肾小管上皮细胞损伤发挥保护作用。本研究为DN药物的研发及基因靶向治疗提供了一定参考。但是，在高糖诱导的HK-2细胞损伤中circLRP6上调的分子机制尚不明确，有待后续进行进一步研究。