杜恒超

艰难梭菌是梭菌属中的一种专性厌氧、有芽孢、产毒素的革兰阳性粗大杆菌，生长营养要求较高，分离培养困难，多栖生在肠道内，可通过粪口途径引发外源性感染，还可在使用大量抗菌药物后由肠道艰难梭菌引发内源性感染[1-2]。研究显示[3]，约25%的抗生素相关性腹泻、75%的抗生素相关性肠炎及近100%的假膜性肠炎由艰难梭菌引起。本研究拟分析老年住院患者艰难梭菌定植情况、流行病学特征及定植危险因素，以期为艰难梭菌感染的防控提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2022 年1—12 月浙江省荣军医院收治入院的老年住院患者300例，纳入标准：（1）年龄≥65 岁；（2）病例资料完整者。排除标准：无粪便或不接受粪便检测者。其中男197 例，女103 例；年龄66 ～97 岁，平均（86.2±9.6）岁。本研究获得浙江省荣军医院人体研究伦理委员会批准，所有研究对象均同意参加本研究并签署书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 艰难梭菌的采集与鉴定 患者入院后均采集其粪便标本，每份粪便样本≥3 mg，将粪便样本按照每份1 mg 分装，取1 mg 粪便标本置于离心管内，并向离心管内注入等体积的无水乙醇，充分震荡后，静置30 min，3 500 r/min，离心15 min，弃去上清液，将沉淀物接种于艰难梭菌鉴定（identification of clostridium difficile，CDIF）选择性培养基上，35 ℃温箱厌氧孵育48 h，根据艰难梭菌的扁平状菌落、镜下革兰染色细菌形态及芽孢位置、马厩性气味等特征挑选可疑菌落，使用梅里埃VITEK MS IND MALDI TOF质谱系统（matrix-assisted laser desorption ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）进行鉴定，鉴定为艰难梭菌阳性的菌株接种于平板上，37 ℃下厌氧培养48 h，并进行纯化、分离，保存艰难梭菌菌株[4]。

1.2.2 DNA的提取 将培养1 ～2 d的艰难梭菌菌落置于无菌0.9%氯化钠注射液中制成0.5 麦氏浊度的菌悬液，以10 000 r/min，离心1 min，弃去上清液，并加入180l 的裂解液，混匀，加入200 mg/ml 的溶菌酶20l，将浓度调整至20 mg/ml，37℃下孵育30 min，转至赛默飞世尔核酸自动提取仪提取核酸，所有操作严格按照说明书进行[5]。

1.2.3 艰难梭菌毒素检测 参考文献[6-7]设计毒素A、B 的基因引物，见表1。反应体系：体积为25l，含12.5l 的2×Tap Master Mix1，10 pmol 引物；反应程序：94 ℃热启动5 min、94 ℃变性40 s、52 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s，共循环30 次后，72 ℃再延伸10 min。所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳，电压110 V，时间20 ～30 min，使用培清JS-680D 全自动凝胶成像分析仪分析。

表1 艰难梭菌毒素检测所用引物

1.2.4 多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST） 参考文献[8]选取7 对看家基因引物（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA 及tpi）测序，引物序列见表2。反应体系：25l 的2×pfu Master Mix，上、下游引物（10 pmol/L）及DNA 模板各2l，19l 的ddH2O；反应程序：94 ℃15 min、94 ℃30 s、50 ℃40 s、72 ℃70 s、共循环35 次后，72 ℃再延伸5 min；扩增产物使用ABI3730xl 全自动测序仪（美国应用生物系统公司）进行测序，测序峰图使用Cromas 软件进行分析。将每一份样品测定的7 家基因序列提交到公用数据库（http://pubmlst.Org/Clostridium difficile）中比对，获得相应的等位基因谱和ST 型。

表2 MLST 引物

1.2.5 信息采集 收集患者病例资料，包括年龄、性别、发热情况、基础疾病（高血压、糖尿病、高血脂及免疫功能低下）、白细胞计数、血清蛋白、血清肌酐、外科手术史、ICU收治、住院时间、自理能力、失能时间、抗生素暴露、使用化疗药物、恶性肿瘤及肝硬化情况。

1.3 观察指标（1）统计艰难梭菌定植率。（2）艰难梭菌毒素基因检测。（3）产毒艰难梭菌的MLST 分型。（4）单因素分析老年住院患者艰难梭菌定植的危险因素。（5）多因素Logistic 回归分析老年住院患者艰难梭菌定植的危险因素。

1.4 统计方法 数据采用SPSS22.0 软件处理，计量资料以均数±标准差表示，采用t 检验；计数资料采用2检验。采用Logistic 回归分析危险因素。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 艰难梭菌定植率 300 例患者粪便标本中，95例患者发现艰难梭菌定植，定植率31.67%。

2.2 艰难梭菌毒素基因检测 95 株艰难梭菌菌株中，非产毒艰难梭菌（毒素基因为tcdA-/tcdB-）16 株（16.84%），产毒艰难梭菌79 株（83.16%），产毒艰难梭菌中毒素基因为tcdA+/tcdB+者51 株（64.56%），毒素基因为tcdA-/tcdB+者28 株（35.44%）。

2.3 产毒艰难梭菌的MLST 分型 79 株产毒艰难梭菌基因组DNA 测序所得数据与数据库比较得出等位基因，共分析出12 个ST 型，其中ST39 型最为常见，共17 株（21.52%）；其次为ST54 型14 株（17.72%），剩余其他各型分别为ST3型8株（10.12%），ST81 型8 株（10.12%），ST35 型7 株（8.86%），ST99 型7 株（8.86%），ST5 型6 株（7.59%），ST42 型5 株（6.33%），ST2 型3 株（3.80%），ST278 型2 株（2.53%），ST102 型1 株（1.27%），ST294 型1 株（1.27%）。

2.4 危险因素的单因素分析 患者年龄较大、免疫功能低下、住院时间长及抗生素暴露均为老年住院患者艰难梭菌定植的危险因素（均P＜0.05），见表3。

表3 老年住院患者艰难梭菌定植危险因素单因素分析

2.5 危险因素的多因素分析 经Logistic 分析显示，年龄较大、免疫功能低下、住院时间长及抗生素暴露是老年住院患者艰难梭菌定植的独立危险因素（均P ＜0.05），见表4。

表4 Logistic 回归分析老年住院患者艰难梭菌定植的独立危险因素

3 讨论

近年来，由于抗菌药物的大量使用，导致艰难梭菌等致病菌的耐药性日益增强，高毒力艰难梭菌菌株NAP1/027/BI的出现，致使艰难梭菌感染暴发，并在世界范围的流行，其高致病率及高死亡率引起广泛关注[9-10]。研究老年人群中艰难梭杆菌感染的分子学流行病学特征及危险因素，对艰难梭杆菌感染的临床防治具有重要意义。

本研究中，300 例粪便标本中，95 例患者发现艰难梭菌定植，定植率为31.67%，高于钱娇等[11]研究中28.6%的感染率，这可能与本研究对象为老年长期住院患者有关。本研究对艰难梭菌菌株进行毒素基因鉴定及MLST 分型结果显示，与祁琪等[12]研究中基本一致。但国外研究显示[13]，产毒艰难梭菌常见ST型为ST42 型、ST17 型、ST378 型。国内外研究中艰难梭菌常见ST型差距较大，说明不同国家艰难梭菌主导菌株差异较大。

本研究分析老年住院患者艰难梭菌感染的危险因素，结果显示，年龄较大、免疫功能低下、住院时间长及抗生素暴露是老年住院患者艰难梭菌定植的独立危险因素。说明年龄较大、免疫功能低下、住院时间长及抗生素暴露的老年住院患者是感染艰难梭菌的高危人群。其原因可能为：（1）老年患者随年龄增高，免疫衰退，机体免疫功能低下，难以抵抗细菌等致病微生物的入侵，机体难以及时清除衰老的死亡细胞，艰难梭菌感染风险较高。（2）长期住院患者多伴有自身免疫功能异常，可增加艰难梭菌感染风险。虞美玲等[14]研究显示，住院时间长是艰难梭菌感染的独立危险因素，与本研究基本一致。（3）抗生素暴露可对患者机体产生影响，导致肠道菌群失调，筛选或诱导出耐药菌株，艰难梭菌定植风险较高。

综上所述，老年住院患者艰难梭菌定植率较高，定植菌株多为产毒艰难梭菌，其基因型以ST39 型最为常见，其次为ST54 型；而年龄较大、免疫功能低下、住院时间长及抗生素暴露是老年住院患者艰难梭菌定植的独立危险因素，临床针对此类高危人群应及时采取干预措施。

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