周小合 谭 红 李宝花 张润玲 吴祥林 夏成静

中国科学院大学深圳医院(光明) 1 检验科 2 神经内科,广东省深圳市 518106

随着广谱抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、细胞毒性药物使用不断增多,导致深部真菌感染疾病而增多,然而支气管和肺脏是最常受累脏器。肺真菌病以曲霉菌感染为主。曲霉菌以腐物寄生的方式存在于自然界中,以烟曲霉菌最为常见,占80%～90%[1]。有研究报道,曲霉性肺炎的病死率为 56%～88.1%[2]。研究表明早期识别早期抗真菌治疗生存率可以提高80%以上[3]。然而,传统检测手段已不能满足临床早期诊断的需求;因此,迫切需要建立早期快速发现曲霉菌的实验室检测新方法。近年来,免疫磁性分离技术应用于病原体检测具有简单、易行、分离纯度较高、可保持靶物质活性等。可使分散在样品中的少量病原体富集,且富集流程仅需要10min～1h[4]。但国内关于曲霉菌富集方法的研究比较少。本研究免疫磁珠技术是对烟曲霉菌富集方法的探究。制定免疫磁珠最佳加入量和烟曲霉菌最佳孵育时间,同时对此研究方案进行敏感度和特异性的验证,以制定完善的烟曲霉菌富集研究方法,为以后曲霉菌快速、早期检测技术奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及抗体。白念珠菌(ATCC10231)、烟曲霉菌(ATCC16907)、金黄色葡萄球菌(ATCC29213)、大肠埃希菌(ATCC25922):菌株来源省临检中心和菌种保存中心,经本实验室传代保存;抗半乳甘露聚糖单克隆抗体:Creative Diagnostics公司。

1.1.2 磁珠。DynabeadsTMM-280 Tosylactivated微珠:赛默飞公司。

1.1.3 培养基和试剂。沙保氏琼脂培养基(SDA)、哥伦比亚血琼脂培养基(CBA):广州迪景公司;BupHTM MES缓冲液干粉包:赛默飞。

1.2 仪器 MJ-250霉菌培养箱:上海跃进公司;LMQ.C压力蒸汽灭菌器:山东新华公司;QL-866振荡仪:其林贝尔公司;鑫贝西生物安全柜:博科公司;磁力架:浙江宁波佳合诚科技公司;HH-S恒温水浴锅:济南欧莱博公司;医用低温保存箱:Biobase有限公司;BX43生物显微镜:奥林巴斯公司;质谱仪:布鲁克公司。

1.3 方法

1.3.1 烟曲霉菌菌种的活化及悬液配置。取出超低温保存的烟曲霉菌株,接种于SDA培养基,28℃真菌恒温培养。培养出菌落后挑取菌落,用生理盐水配制菌悬液,使烟曲霉菌分生孢子充分悬浮于盐水中,均质化后配置成0.5麦氏浊度烟曲霉菌悬液。

1.3.2 免疫磁珠添加量的确定。分别取抗半乳甘露聚糖单克隆抗体免疫磁珠(30mg/mL)10、30、50、80、100、120、140、170、190μL,加到1 000μL经稀释至104cfu/mL的烟曲霉菌悬液中,充分混匀后,在37℃轻轻振荡孵育30min;将离心管置于磁力架,静置2min,弃上层液体。加入1mL PBS缓冲液轻轻重悬,在磁力架上静置2min,移除上层液体,重复操作2次。最后加入1mL PBS缓冲液振荡混匀重悬磁珠,吸取10μL涂布于SDA平板,置于28℃霉菌培养箱培养3d观察菌落并计数。

1.3.3 免疫磁珠与烟曲霉菌液最佳反应时间。分别取抗半乳甘露聚糖单克隆抗体免疫磁珠(30mg/mL)100μL,加到1 000μL经稀释至104cfu/mL的烟曲霉悬液中,轻微振荡摇匀;放37℃孵育,分别孵育反应15、30、45、60、120min;磁珠重悬、吸附、再接种平板重复1.3.2富集操作步骤。

1.3.4 免疫磁珠富集烟曲霉菌的敏感性实验。将配置好0.5麦氏浊度烟曲霉菌悬液,按10倍配比稀释,每个浓度进行定量培养计数。取10μL接种SDA平板,28℃ 培养3d观察菌落并计数。另取抗半乳甘露聚糖单克隆抗体磁珠(30mg/ml)100μL,分别加到1 000μL各浓度烟曲霉菌悬液中,轻微振荡混匀,置37℃孵育30min;按照1.3.2步骤磁珠重悬、吸附。再加入10μL PBS缓冲液振荡重悬磁珠,吸取10μL涂布于SDA平板,置于28℃霉菌培养箱培养3d观察菌落并计数。

1.3.5 免疫磁珠富集烟曲霉菌特异性验证。把100μL抗半乳甘露聚糖单克隆抗体免疫磁珠,分别加入1mL经稀释至104cfu/mL的常见病原体:烟曲霉、白念珠菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌菌悬液中。充分混匀后,置37℃ 40r/min振荡孵育反应30min后;按照1.3.2步骤磁珠重悬、吸附。再吸10μL重悬磁珠涂布于CBA培养基;同时吸未富集前各种菌悬液10μL涂布于CBA培养基;置28℃培养3d观察菌落并计数。

2 结果

2.1 免疫磁珠添加量的确定 随着免疫磁珠量的增多,烟曲霉菌生长越旺盛,而在磁珠量约为100μL时,烟曲霉菌繁殖生长的菌落数量最多,此时烟曲霉菌富集效果最好。若当加入的磁珠量过多,烟曲霉菌生长状态菌落数变少,富集效果不是最佳,可能是出现了带现象,确定免疫磁珠100μL是富集最佳量。见表1。

表1 免疫磁珠添加量与烟曲霉菌生长菌落数关系

2.2 免疫磁珠与烟曲霉菌液最佳孵育时间 免疫磁珠与烟曲霉菌富集孵育最佳时间为30min。若富集时间延长或缩短,均能使抗原抗体结合的亲和力减小,增加非特异性反应等。见表2。

表2 免疫磁珠孵育时间与烟曲霉菌生长菌落数关系

2.3 免疫磁珠富集烟曲霉菌的敏感性实验 将0.5麦氏浊度烟曲霉菌液,按照10倍稀释梯度逐步稀释到10-6,然后对各个稀释度菌液,富集前、后各取10μL涂布SDA培养基培养3d后观察菌落并计数。实验结果见表3。当菌悬液稀释度为10-5时,直接涂布接种SDA培养基,培养3d无烟曲霉菌生长;但菌液稀释度为10-6免疫磁珠富集烟曲霉菌后,再涂布SDA平板培养依然能够检出,免疫磁珠富集烟曲霉菌培养检出率明显优于直接培养法。说明此富集方法极大提高了检测敏感性。

表3 各稀释度富集前、后的敏感性实验

2.4 免疫磁珠富集烟曲霉菌的特异性实验 将100μL抗半乳甘露聚糖单克隆抗体免疫磁珠,分别加入相同浓度梯度的烟曲霉菌、白念珠菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌菌液中,阴性对照(生理盐水)。经2次重悬洗涤、富集、培养、鉴别;实验表明烟曲霉菌经磁珠富集后培养,比直接接种培养菌落计数显著增加;其他病原菌经此免疫磁珠富集后培养,相比直接培养菌落计数明显减少或未检出;阴性对照(生理盐水)尚未检出,说明此免疫磁珠富集方法特异性强。见表4。

表4 各病原菌富集前、后培养计数

3 讨论

曲霉菌是一种环境腐生菌,对生长环境条件要求低,一般在20～50℃潮湿和碳源充足的环境中可生存。而在临床工作中,曲霉病临床样本的阳性检出率偏低。有研究数据表明,在侵袭性肺曲霉菌病患者痰液中,分离出曲霉菌的阳性率仅为8%～34%,即使在肺泡灌洗液中,阳性率也只有50%[5]。曲霉菌的分离率不高,推测可能与临床样本留取类型或采样时机有关,也有可能与检验人员缺乏对病史的了解,培养条件或时间不足有关;在检测手段方面传统涂片、培养方法,所需的检测数量阈值较高,假阴性结果延误早诊早治。因此检测领域用于曲霉菌快速、准确的检测方法迫切需求。

近年来,真菌抗原检测技术方面得到广泛应用,G试验是检测 (1,3)-β-D 葡聚糖,其含量是大部分真菌感染共同的指标,但作为真菌检验指标假阳性或假阴性的情况也时有发生[6],常用于无菌体液和血液检查。半乳甘露聚糖(GM)试验也被欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)纳入真菌感染的证据之一。GM是曲霉菌细胞壁上的多糖成分,但是有些药物对GM试验干扰,会出现假阳性[7]。目前分子生物学技术、二代测序技术用于致病真菌的核酸检测是研究热点,但仪器价格昂贵、检测费用高,难以在临床推广应用。目前国内外研究发现细菌富集技术是提升细菌检测效果的有效途径,免疫磁性分离技术已被用来富集和检测各类致病细菌。刘珂等[8]研究建立的IL-6磁微粒化学发光定量检测方法性能良好。有研究报道,人排泄物中有幽门螺杆菌、尿液中血吸虫循环抗原以及水体中的贾第虫孢囊和隐孢子虫卵囊等[9]。因真菌抗原性不同, 单克隆抗体针可特异性地检测病理组织中的致病菌[10]。黄茜等研究提取曲霉菌GM作为抗原免疫BALB/c 小鼠,可获得针对曲霉菌GM的单克隆抗体[11]。马梦男等[12]研究显示,曲霉半乳甘露聚糖磁微粒化学发光法检测方法性能良好。

本研究证实了当免疫磁珠加入量为100μL、免疫磁珠和烟曲霉菌液孵育时间30min,免疫磁珠对烟曲霉菌的富集分离作用最强。该方法与传统真菌检测方法涂片、培养相比较有显著优势,提高了检测敏感性和特异性,有助于早期烟曲霉菌感染的检出效率。本研究是对引起侵袭性肺曲霉菌感染的主要病原体烟曲霉菌而设计,此方案对于其他曲霉菌属真菌富集技术是否可行,有待后续研究再进一步分析评价。

综上所述, 通过对免疫磁珠富集烟曲霉菌的方法和条件研究,确定了富集烟曲霉菌最佳的免疫磁珠量以及烟曲霉菌液最佳反应时间。基于该方法的建立,对此富集技术进行验证,经验证此研究方案具有较高的敏感性和特异性。由此推测此研究,能够应用于早期烟曲霉菌感染常规检测技术中,能提高曲霉菌检出效率。