江晓倩 张玉琴 滕海英

1 福建中医药大学附属康复医院,福建省福州市 350003; 2 福建中医药大学

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是一种以关节软骨退行性改变、滑膜炎症反应、关节间室变窄和关节继发性骨质增生为主要病理特征的慢性进行性骨关节病,是临床常见的骨科疾病之一。KOA好发于40岁以上中老年人[1],随着我国进入老龄化社会,KOA的发病人数也在与日俱增,总患病人数可高达3 000万[2]。KOA在中医学属“痹证”“痿证”等范畴,国家中医药管理局将其命名为“膝痹”[3]。中医痹病理论始于《内经》,《素问·痹论》首次提出骨痹、筋痹、脉痹的概念,中医理论将其病因病机概括为肝肾亏虚、筋骨失养、气血不足、风寒湿邪痹阻所致,具有本虚标实的特点[4]。

中药外敷法是中医骨伤科临床治疗膝骨关节炎诊疗指南中推荐的药物疗法之一,具有不良反应小、减轻关节疼痛效果明显等优势。目前临床常用的外敷方功效多以活血化瘀、通络止痛为主,将药剂贴敷于患处或穴位肌肤具有增强软骨细胞活力、促进其增殖、抑制炎症和组织水肿、降低骨内压、缓解疼痛等作用[5]。“盐敷方”为福建中医药大学附属康复医院外用经验方,其主药成分有:乳香、没药、制吴茱萸、丁香、紫苏子、炒莱菔子、大青盐。本方具有活血行气、祛寒止痹、通络止痛的功效,与大青盐合用可引药入肾,携药渗透入里,从而增强药效,在临床上取得了较好的疗效。

网络药理学的发展为探究中药方剂的活性成分和潜在作用机制提供了一种新思路。本研究运用网络药理学的方法对盐敷方治疗膝骨关节炎的分子作用机制进行探讨,为后期盐敷方作用机制的研究提供了理论参考。

1 方法

1.1 盐敷方有效成分收集及药物靶点预测 以乳香、没药、制吴茱萸、丁香、紫苏子、炒莱菔子作为检索词在 TCMSP 数据库[6](https://tcmspw.com/tcmsp.php)检索,获得这6味中药的化学成分信息,将筛选条件设置为生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL值)≥0.18[7],筛选出盐敷方中符合条件的活性成分。再通过Uniprot(https://www.Uniprot. org/) 数据库[8]对搜集的六味中药活性成分所对应的靶点进行名称校正。

1.2 构建膝骨关节炎—靶点基因预测 在Disgenet(https://www.disgenet.org)[9]与Drugbank(https://go.drugbank.com)数据库[10]中以“knee osteoarthritis” “osteoarthritis,knee”为关键词,种属选择“Homo sapiens”筛选与疾病相关的靶点,将两数据库搜索结果合并去重,获得疾病靶点基因。

1.3 获取交集基因及网络构建

1.3.1 构建盐敷方成分靶点网络图。运用cytoscape3.10.0软件导入盐敷方中各组分的化学成分及所对应的靶点基因,构建盐敷方成分—靶点网络。

1.3.2 构建盐敷方—膝骨关节炎共同靶点网络。将盐敷方活性成分作用靶点和膝骨关节炎靶点基因取交集,获得盐敷方与膝骨关节炎的共同靶点。

1.4 构建蛋白相互关系网络(PPI) 将获得的共同靶点导入 String 数据库[11](https://string-db.org),物种设定为“Homo sapiens”,其他筛选条件选择默认参数,从而构建盐敷方治疗膝骨关节炎共同靶点蛋白可视化网络。

1.5 GO富集分析及KEGG富集分析 将“盐敷方—膝骨关节炎”中共同靶点导入到 Metascape(https://metascape.org)[12]中进行通路富集分析。在Metascape的基因面板中粘贴基因列表,将物种限定设置为人类(Homo sapiens),后进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。富集条件设置为P<0.01,重叠值(Overlap)≥3,富集值(Enrichment)≥1.5。GO分析的过程主要包括三个方面:生物过程分析(BP)、细胞成分分析(CC)、分子功能分析(MF)。最后利用微生信网站对结果进行可视化。

2 结果

2.1 盐敷方的成分及作用靶点 运用TCMSP数据库共筛选出盐敷方组方的94个活性成分,其中乳香6个,没药34个,紫苏子14个,吴茱萸32个,丁香6个,莱菔子2个,剔除重复项后获得86个活性成分。通过Uniprot数据库对TCMSP数据库检索出的盐敷方组方中活性成分所对应的作用靶点进行名称校正后,共获得255个活性成分作用靶点。

2.2 膝骨关节炎的作用靶点 通过检索Disgenet与Drugbank数据库,以“knee osteoarthritis”“osteoarthritis,knee”为关键词进行检索,两个数据库所得的靶点信息整合、去重后,总共获得415个疾病靶点。

2.3 构建盐敷方活性成分—膝骨关节炎共同靶点网络 将盐敷方活性成分作用靶点和膝骨关节炎靶点基因取交集,筛选出盐敷方与膝骨关节炎的共同靶点51个,这些靶点为盐敷方治疗膝骨关节炎的潜在作用靶点。这51个靶点对应的盐敷方活性成分共有54个,导入cytoscape3.10.0软件,构建“盐敷方活性成分—共同靶点网络图”,见图1。

图1 盐敷方活性成分—共同靶点网络图

2.4 PPI网络的构建 通过String数据库在线构建的盐敷方活性成分和膝骨关节炎共同靶点的PPI网络包含51个节点和608条线将这些节点相连接,见图2。将这51个共同靶点按照自由度(degree)值进行排序,排名前十的靶点为TNF、IL-6、IL-1β、ALB、PTGS2、CCL2、MMP9、TP53、HIF1A、IL-10,其中TNF、IL-6的自由度值最高,均为45。表明这些靶点为盐敷方治疗膝骨关节炎的核心靶点,可能在盐敷方治疗膝骨关节炎中发挥核心作用。

图2 盐敷方—膝骨关节炎共同靶点PPI网络图

2.5 GO与KEGG 富集分析

2.5.1 GO富集分析。GO功能富集分析共涉及882条生物过程、26种细胞组分、78个分子功能,根据基因富集程度进行排序,列举排名前十位的功能,并绘制三合一气泡图,详见图3。结果显示:(1)盐敷方治疗膝骨关节炎的生物过程通路(BP)主要富集于炎症反应(inflammatory response)、炎症反应的调节(regulation of inflammatory response)、细胞对脂质的反应(cellular response to lipid)、细胞运动的正向调节(positive regulation of cell motility)等。(2)细胞成分分析(CC)主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、血小板颗粒腔(platelet alpha granule lumen)、血小板α颗粒(platelet alpha granule)等细胞成分。(3)分子功能分析(MF)主要涉及细胞因子活性(cytokine activity)、信号受体调节活性(signaling receptor regulator activity)、细胞因子受体结合(cytokine receptor binding)、受体配体活性(receptor ligand activity)等分子功能。

图3 盐敷方—膝骨关节炎共同靶点GO富集分析图

2.5.2 KEGG富集分析。KEGG 通路富集分析共获得119个条目,对富集基因最多的前20条信号通路进行可视化,见图4。与膝骨关节炎相关的KEGG通路主要涉及:IL-17(IL-17 signaling pathway)、肿瘤坏死因子(TNF signaling pathway)、类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis)、核因子κB(NF-kappa B signaling pathway)等信号通路。

图4 盐敷方—膝骨关节炎共同靶点 KEGG通路富集分析图

3 讨论

膝骨关节炎是一种关节软骨退行性病变,严重影响患者生活质量。其病理特征随病程变化,所受累组织不同而呈现出多方面的改变,包括软骨下骨增生硬化、关节软骨退变、骨赘形成、滑膜增厚等[13]。当前研究显示KOA的发病机制尚不明确,其病机主要包括软骨退变、软骨下骨代谢异常、滑膜炎症等[14]。“盐敷方”热敷外用可起到扩张血管、改善局部血液循环、消除炎症、改善关节功能、减轻疼痛的作用,具有疗效确切、不良反应少、可用于长期治疗等优点。但由于缺乏动物实验数据支持及其作用机制尚未明确,使得其难以广泛推广运用于临床。

文章采用网络药理学的分析方法,对“盐敷方”进行了数据库层面的机制探究。根据PPI网络分析结果可知,TNF、IL-6、IL-1β、ALB、PTGS2、CCL2、MMP9、TP53、HIF1A、IL-10等为关键靶点基因。患者血清及滑膜组织中的肿瘤坏死因子TNF、白细胞介素因子IL-6、IL-1β是评价药物治疗膝骨关节炎疗效的重要指标。研究表明,TNF、IL-6、IL-1β、IL-10可激活机体产生炎症反应,是参与KOA病程发展的关键炎症因子[15-16]。TNF可影响软骨细胞的生成与凋亡,可分解代谢软骨组织,导致关节软骨的破坏[17]。 IL-1β不仅可以独立诱导软骨细胞炎性损伤[18],还可刺激COX-2、iNOS等的产生,激活炎症途径从而诱导炎症性疼痛[19]。IL-6可加快生成IL-1β,破坏软骨组织中TIPM和MMPs的平衡,使细胞外基质结构失衡,从而破坏关节软骨[20]。环氧合酶PTGS2亦是炎症反应重要靶点,通过将花生四烯酸转化为 PGH2 从而诱导炎症[21]。基质金属蛋白酶9(MMP9)可通过降解软骨基质中的胶原蛋白和蛋白多糖等成分,而诱导软骨细胞发生凋亡坏死,从而导致加重炎症反应[22]。由此推测,盐敷方可通过调控炎症因子、诱导软骨细胞的生成与凋亡等途径,改善膝骨关节炎。

GO分析发现,盐敷方治疗膝骨关节炎主要涉及炎症反应、炎症反应的调节、细胞对脂质的反应等生物过程。滑膜炎症是膝骨关节炎重要病理表现之一,盐敷方可通过参与炎症反应与炎症反应的调节,改善滑膜组织炎症。在KOA的早期阶段,就可以观察到脂质沉积在关节腔内[23]。研究表明,脂质与炎症反应息息相关。棕榈酸可通过TLR4-ERK1/2-c-Jun信号通路增加软骨细胞中IL-26的表达,促进炎症反应[24]。抵抗素可通过MEK/ERK信号通路,促进关节滑液中IL-1β和TNF-α的表达,激活炎症反应[25]。

KEGG富集通路分析结果显示,盐敷方治疗膝骨关节炎主要涉及IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、类风湿关节炎信号通路、核因子κB信号通路等。IL-17、TNF、NF-κB信号通路都是与KOA病程发展密切相关的炎症信号通路。研究表明,IL-17信号通路可通过诱导释放炎症因子,提升中性粒细胞的趋化能力,降低相关酶的活性,引起炎症反应的加剧和关节软骨的破坏[26-27]。同时,IL-17信号通路能够异常激活NF-κB途径中的炎症因子,调控促炎性细胞因子TNF、IL-6、IL-1β等的表达,增强炎症反应,加重关节软骨的损伤[28-30]。TNF信号通路中的TNF-α不仅可诱导产生大量炎症,同时可以激活NF-κB信号通路,诱导产生基质金属蛋白酶MMP,从而加速软骨的破坏[31]。由此推测,盐敷方可通过调控多条炎症信号通路从而治疗膝骨关节炎。

综上所述,通过网络药理学方法可得盐敷方治疗膝骨关节炎具有多靶点、多途径的特点,可通过下调细胞因子表达、抑制炎症反应、减慢软骨降解退变来延缓KOA的发展。文章对盐敷方作用机制进行了数据库水平的分析,为后续研究奠定了坚实的理论基础,接下来我们将对盐敷方如何调控细胞因子表达及其更深层次的抗炎机制进行实验研究。