李经堂 涂乐佳 陈 淼 魏 鹏 周璟瑜

江西省人民医院(南昌医学院第一附属医院) 1 创伤急救科 2 血管外科,江西省南昌市 330006 ; 3 南昌大学医学院骨科

骨缺损是指骨组织中连续的骨结构丧失,骨组织完整性被破坏进而影响骨骼强度和功能[1]。外科手术是目前治疗骨缺损的常用手段,主要是将自体或异体骨组织移植到骨缺损部位并应用人工材料辅助支撑及修复,但自体骨来源有限,异体骨移植可能会出现排异反应等并发症导致植骨失败,同时手术有局部感染和术后愈合不良的风险,在临床应用上有一定局限性[2-3]。祖国医学博大精深,中医药治疗骨科疾病经验丰富,传统中药用于骨伤治疗的历史悠久,疗效确切[4]。龙血竭是来源于百合科植物剑叶龙血树树脂的传统中药,具有活血化瘀、通络止痛的功效,对于扭伤、骨折、骨质疏松等骨伤病症均有较好疗效[5-6]。龙血素B是其主要活性成分之一,研究表明,龙血素B可通过P38MAPK信号通路抑制破骨细胞增殖[7]。骨缺损的修复与破骨细胞和成骨细胞相互协调作用密切相关,而龙血素B对于成骨细胞的作用暂未见有文献报道。基于此,本研究培养小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞),加入龙血素B单体共培养进行干预实验,观察龙血素B对MC3T3-E1细胞增殖分化、成骨能力的影响,并以P38MAPK信号通路为切入点探究其作用机制,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞来源和实验试剂 MC3T3-E1细胞由中国科学院上海生命科学研究院提供。DMEM培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司,龙血素B、SB203580、茜红素购自武汉三鹰生物技术有限公司,碱性磷酸酶(ALP)活性检测试剂盒、反转录试剂盒、CCK8试剂盒、细胞凋亡试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和龙血素B干预。MC3T3-E1细胞于-80℃冰箱中保存,取出冻存管置于37℃水浴锅中快速解冻,酒精消毒后移入生物安全柜,配置含10%FCS的DMEM培养液,使用培养液重悬细胞,接种于培养皿中,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。培养3～6代后,选取对数生长期的MC3T3-E1细胞,0.25%胰蛋白酶消化,制备细胞悬液,调整密度为1.0×105个/mL,接种于96孔板,每孔100μL,置于培养箱继续培养过夜;弃去原培养液,分别加入含龙血素B浓度为0、15、30、60、90、120μmol/L的完全培养基溶液各90μL,阴性对照组加入完全培养基90μL,于培养箱中继续培养。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖活性。龙血素B干预24h、48h、72h后,弃去含药培养液,每孔加入CCK-8溶液10μL,振荡混匀,于细胞培养箱中孵育2h;酶标仪检测450nm波长处吸光度(OD值),以此反映细胞增殖活性,增殖率=(OD加药组-OD对照组)/OD对照组×100%。

1.2.3 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡水平。取MC3T3-E1细胞,制备密度为1.0×105个/mL的细胞悬液,接种于6孔板,每孔2mL。按上述步骤采用不同浓度及作用时间龙血素B干预,消化收取细胞,离心后PBS洗2次,加入Binding Buffer重悬,按照细胞凋亡试剂盒方案染色,使用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.2.4 细胞分组。根据不同浓度及作用时间给药干预后细胞增殖和凋亡检测结果,以MC3T3-E1细胞增殖率达到峰值的龙血素B浓度和作用时间为基础进行后续实验。将MC3T3-E1细胞接种于6孔板,按不同干预方式分为3组,空白组:常规培养,不做任何干预;龙血素B组:以最佳浓度及作用时间龙血素B干预;龙血素B+阻断剂组:以龙血素B+10μmol/L P38抑制剂SB203580干预。干预结束后继续弃去含药培养液,更换为成骨诱导培养基(含1%甘油磷酸钠、0.2%抗坏血酸、0.01%地塞米松)继续培养,每3d换液。

1.2.5 各组细胞ALP活性测定。分别于干预结束后第1、3、5天测定各组细胞ALP活性。弃去培养液,PBS洗2次,加入细胞裂解液使细胞充分裂解,按试剂盒说明配制对硝基苯磷酸(PNPP)显色底物溶液,样品与底物在pH 10.3的反应缓冲液内,37℃下反应30min,加入反应终止液终止反应。酶标仪检测405nm波长处吸光度(OD值),ALP活性与OD405值成正比。

1.2.6 qRT-PCR法检测各组细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平。干预结束后,收取各组细胞,采用TRIzol法提取总RNA,依照反转录试剂盒说明获取cDNA,以cDNA为模板,进行PCR扩增。内参为GAPDH,OPN、OCN、BSP的mRNA相对表达水平采用2-ΔΔCt计算。

1.2.7 茜素红染色法观察各组细胞骨形成能力。干预结束后第21天对各组细胞进行茜素红染色,观察钙化结节形成情况。弃去培养液,PBS洗涤细胞,加入95%酒精固定10min,PBS洗涤后使用0.1%茜素红染色,避光孵育30min,去离子水洗去浮色,置于显微镜下观察拍照,Image J软件分析钙化结节面积百分比。

2 结果

2.1 龙血素B对MC3T3-E1细胞增殖的影响 同一时间点,MC3T3-E1细胞增殖率与龙血素B浓度正相关,药物浓度为90μmol/L时,细胞增殖率相比于药物浓度较低时明显升高(P<0.05),且与药物浓度为120μmol/L时无统计学差异(P>0.05);相同浓度下,龙血素B干预48h时MC3T3-E1细胞增殖率明显高于24h和72h(P<0.05)。见图1。

图1 龙血素B对MC3T3-E1细胞增殖的影响

2.2 龙血素B对MC3T3-E1细胞凋亡的影响 同一时间点,MC3T3-E1细胞凋亡率与龙血素B浓度负相关,药物浓度为90μmol/L时,细胞凋亡率相比于药物浓度较低时明显降低(P<0.05),且与药物浓度为120μmol/L时无统计学差异(P>0.05);相同浓度下,龙血素B干预48h时MC3T3-E1细胞凋亡率明显低于24h和72h(P<0.05),见表1。基于2.1和2.2结果,选择龙血素B浓度90μmol/L,作用时间48h作为后续实验干预条件。

2.3 各组MC3T3-E1细胞ALP活性比较 在干预后第1、3、5天时,龙血素B组MC3T3-E1细胞ALP活性均高于空白组和龙血素B+阻断剂组(P<0.05)。见图2。

图2 各组MC3T3-E1细胞ALP活性比较

2.4 各组MC3T3-E1细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平比较 龙血素B组MC3T3-E1细胞OPN、OCN、BSP的mRNA相对表达量均高于空白组和龙血素B+阻断剂组(P<0.05)。见图3。

图3 各组MC3T3-E1细胞OPN、OCN、BSP基因表达水平比较

2.5 各组MC3T3-E1细胞骨形成能力比较 龙血素B组MC3T3-E1细胞钙化结节区域面积较空白组显著增大,而龙血素B+阻断剂组细胞钙化结节区域面积较龙血素B组显著减小(P<0.05)。见图4。

图4 各组MC3T3-E1细胞骨形成能力比较

3 讨论

骨缺损一般由感染、创伤、肿瘤、骨质代谢异常等因素引起,其症状与缺损部位和严重程度有关,表现为疼痛、肢体畸形、关节活动障碍等,严重影响患者生活质量[8-9]。近年来,运用现代科学方法提取分离中药活性成分并进行研究分析已成为热门方向,单一活性成分即中药单体的作用及机制研究对提升传统中药疗效,减少副作用具有重要意义,已有多种中药单体被证明对骨缺损的修复有促进作用[10-11]。龙血素B是“活血圣药”龙血竭中黄酮类的主要活性成分,相关研究显示其具有消炎、镇痛、抗氧化多种生物活性,对于神经细胞、肝星状细胞、破骨细胞等多种细胞的增殖分化和功能发挥均有调控作用[12-13]。成骨细胞是人体骨组织的重要组成成分,也是参与骨形成的主要功能细胞,在骨骼生长发育及骨量维持方面扮演着关键角色。它来源于具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞,经细胞增殖、细胞外基质合成、成熟及矿化后最终发展成为骨细胞,参与骨形成及骨修复[14]。本研究体外培养成骨前体细胞株MC3T3-E1细胞,并分析其与龙血素B共培养时的增殖和凋亡情况,结果显示,龙血素B可促进MC3T3-E1细胞增殖并抑制其凋亡,且效果呈现一定的浓度依赖性,其促MC3T3-E1细胞生长的最佳浓度和作用时间为90μmol/L、干预48h。而成骨细胞数量增加是骨基质合成和骨组织生长的基础,提示龙血素B对骨的形成具有促进作用。

MC3T3-E1细胞为成骨前体细胞,可分化为成熟成骨细胞,进而合成分泌骨基质,并促进钙化和新骨形成,研究表明,P38MAPK信号通路对其成骨分化有重要影响[15]。为进一步探究龙血素B对MC3T3-E1细胞成骨分化和骨形成的影响,本研究使用龙血素B对MC3T3-E1细胞进行干预,并加入抑制剂SB203580阻断P38MAPK信号通路,从细胞水平探讨其刺激骨分化和骨形成的作用机制。ALP可促进羟基磷灰石的沉积,是骨形成早期标志物;OPN、OCN、BSP是成骨特定基因,其表达和相应蛋白的合成可促进羟磷灰石矿化的成核作用,并增加钙结节形成,可反映MC3T3-E1细胞成骨分化程度[16]。本研究结果显示,龙血素B干预后,MC3T3-E1细胞ALP活性和成骨相关基因表达水平均显著升高,而阻断P38MAPK信号通路后,MC3T3-E1细胞ALP活性和成骨相关基因表达水平显著下降,提示龙血素B可有效促进MC3T3-E1细胞的成骨分化,且这一作用与P38MAPK信号通路相关。成骨分化中晚期以钙离子沉积为主,钙结节形成越多,表明新骨形成能力越强[17]。本研究结果显示,龙血素B干预下,成骨诱导后MC3T3-E1细胞钙化结节区域面积显著增大,而加入P38MAPK阻断剂后MC3T3-E1细胞钙化结节区域面积显著减小,表明龙血素B可通过P38MAPK信号通路在新骨形成过程中发挥促进作用。

综上所述,龙血素B可通过调控P38MAPK信号通路,促进MC3T3-E1细胞增殖,刺激成骨分化和骨形成。为临床上骨缺损的治疗提供新的思路和理论依据,值得进一步研究。