刘阗生, 热孜亚·艾买提, 阿衣努尔·热合曼, 陈媛鑫, 卡依沙尔, 阿衣努尔·买提斯迪克

(1新疆医科大学维吾尔医学院, 乌鲁木齐 830017; 2西南医科大学附属中医医院继续教育部, 四川 泸州 646000;3南京中医药大学党委学生工作部, 南京 210029)

骨质疏松症(Osteoporosis,OP)被认为是以骨量低和骨组织微结构退化为特征的进行性系统性骨骼疾病[1],常伴有骨量低、骨脆性增加、骨折等症状[2]。伴随着人口老龄化的加重,骨质疏松症的患病率也显著增加,因此预防及治疗手段当务之急,而我国对骨质疏松的研究仍存在较大缺口[3]。正常的骨内环境是成骨细胞的骨形成作用与破骨细胞的骨吸收作用处于平衡状态,以此来保持正常的骨稳态[4];而骨稳态的破坏被认为是骨质疏松症的发病原因之一。Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)作为成骨细胞成熟的关键蛋白,可以通过调节骨细胞特异性转录因子(Osterix,OSX)的表达,以达到诱导前成骨细胞成骨分化的目的[5-6]。糖皮质激素具有抗炎及免疫抑制活性,被广泛应用于临床治疗;同时,有研究显示糖皮质激素对成骨细胞的成骨能力与增殖能力具有抑制作用,长期使用糖皮质激素也是造成骨质疏松症的重要原因之一[7]。作为使用较为普遍的糖皮质激素,地塞米松具有抑制成骨细胞增殖的作用[8]。

本课题组前期研究中发现祛湿健骨方具有促进骨形成、减少骨吸收的作用,同时能够改善血清雌二醇、骨钙素、抗酒石酸性磷酸酶等骨代谢指标及骨生物力学性能的紊乱状态,有效提高骨密度[9],但该方未有分子层面的相关研究。本研究对祛湿健骨方分子层面的作用机制进行研究,利用地塞米松对MC3T3-E1细胞成骨能力的抑制作用,使用地塞米松建立MC3T3-E1细胞激素性骨质疏松症模型,并通过检测细胞中RUNX2、OSX蛋白的表达水平,探讨祛湿健骨方对激素性骨质疏松症的影响机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂MC3T3-E1细胞购自武汉普赛诺生命科技有限公司(CL-0378);地塞米松购自Sigma公司;CCK-8试剂盒、ALP检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、RIPA(强)裂解液购自碧云天生物技术有限公司;RUNX2(A11753)、OSX(A18699)、GAPDH(A19056)抗体购自爱博泰克公司。

1.2 方法

1.2.1 含药培养基配置 用完全培养基溶解祛湿健骨方[9]内药物,配成浓度为50 mg/mL 的母液,然后微孔过滤,-20℃长期保存。加药时现用现配,用 MEM-ɑ完全培养基(含10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素溶液) 进行稀释, 分别配成0.005、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL浓度。

1.2.2 CCK-8检测 细胞增殖各处理组细胞消化后制成混悬液,经离心,弃上清液,加入新完培吹打均匀并计数,均匀分布于96孔板(每孔200 μL),调整每孔细胞数量为1×104个。待细胞贴壁后,弃去原有培养基,再加入含药培养基进行干预。48 h后加入CCK-8溶液,比例为1/10(即 200 μL培养液加入20 μL检测液;)在孵育1h后,酶标仪读板,CCK-8检测读取OD450数据。增殖率计算公式=(实验组OD值均值÷对照组OD值均值)×100%。

1.2.3 细胞分组及造模 借助地塞米松对MC3T3-E1细胞成骨能力抑制的特性,使用地塞米松干预细胞以创造MC3T3-E1细胞激素性骨质疏松的环境。新6孔板明胶包被30 min,回收明胶,待板干后,将MC3T3-E1细胞制成细胞悬液,铺于6孔板上,分为对照组(不使用地塞米松与祛湿健骨方干预)、地塞米松组(1 μmol/L地塞米松处理细胞48 h)、祛湿健骨方低、中、高浓度组(分别使用0.1、0.2、0.4 mg/mL的祛湿健骨方+1 μmol/L地塞米松共同处理)干预48 h后,更换成骨分化诱导培养基继续培养15 d,每隔3 d换液培养[10]。

1.2.4 检测ALP表达水平 收集培养处理15 d后的MC3T3-E1细胞,加入RIPA(强)裂解液,使细胞裂解并释放细胞内的成分。低温离心机12 000 r/min离心10 min,仔细收集上清。使用碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)试剂盒检测 ALP 的表达水平。

1.2.5 检测RUNX2,OSX的蛋白表达 收集各组MC3T3-E1细胞,根据说明书加入适量RIPA裂解液,低温离心机12 000 r/min 离心10 min,取上清液,用BCA检测各组蛋白浓度。配平各组蛋白浓度,做变性处理。后取适量蛋白进行蛋白质印迹法实验,经电泳转膜后,分别加入RUNX2、OSX、GAPDH抗体4℃孵育过夜,洗膜后,加入二抗室温下孵育1 h,加入显色剂,在曝光仪下曝光。结果采用ImageJ软件分析。

2 结果

2.1 祛湿健骨方对MC3T3-E1细胞的增殖作用影响对比对照组,地塞米松组细胞活性降低;经祛湿健骨方含药培养基干预48 h后的MC3T3-E1细胞,活性明显升高, 按药物浓度等比增长, 浓度大于0.05 mg/mL时尤为明显,见图1。经CCK-8实验结果对比,药物筛选出低浓度(0.1 mg/mL)、中浓度(0.2 mg/mL)、高浓度(0.4 mg/mL)3个最大存活率浓度。

注： A, 对照组; B, 地塞米松组; C,0.005 mg/mL浓度药物; D, 0.025 mg/mL浓度药物; E, 0.05 mg/mL浓度药物; F, 0.1 mg/mL浓度药物; G, 0.2 mg/mL浓度药物; H, 0.4 mg/mL浓度药物。

2.2 地塞米松+祛湿健骨方干预下MC3T3-E1细胞ALP活性的变化对照组、地塞米松组、低剂量组、中剂量组、 高剂量组OD值分别为0.170±0.012、 0.057±0.001、 0.062±0.002、 0.074±0.006、 0.109±0.016。与对照组相比,地塞米松组、低剂量组、中剂量组、高剂量组细胞ALP活性均降低差异有统计学意义(P<0.05);与地塞米松组相比,低剂量组、中剂量组差异无统计学意义(P>0.05);高剂量组细胞ALP活性升高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 MC3T3-E1细胞中RUNX2、OSX蛋白的表达

2.3 地塞米松+祛湿健骨方对MC3T3-E1细胞RUNX2、OSX蛋白表达的影响与对照组比较,中剂量组、低剂量组、地塞米松组细胞的RUNX2、OSX蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量组细胞OSX和RUNX2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);与地塞米松组比较,高剂量组OSX和RUNX2蛋白表达差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1,图2、3、4。

图2 OSX和RUNX2蛋白在MC3T3-E1细胞中的表达

图3 RUNX2蛋白在MC3T3-E1细胞中的表达

图4 OSX蛋白在MC3T3-E1细胞中的表达

3 讨论

随着OP发病率的日益增高,对OP的预防和治疗迫在眉睫。成骨细胞被抑制,破骨细胞增殖导致的骨内环境稳态紊乱与OP的发生密切联系[11]。糖皮质激素导致骨稳态失衡是诱发骨质疏松的危险因素;促进成骨细胞增殖,以此改善激素性OP成为目前研究的热点[12]。地塞米松是较为常用的糖皮质激素,有研究表明,地塞米松能够抑制成骨细胞的成骨能力[13]。ALP参与骨形成作用,是成骨细胞成熟的重要标志物[14]。本研究使用地塞米松干预MC3T3-E1细胞,发现地塞米松组细胞ALP活性相较于对照组明显降低;而药物+地塞米松共同处理的细胞ALP活性较地塞米松组明显升高,且随药物浓度的增高呈正相关趋势,证实了祛湿健骨方对MC3T3-E1细胞的成骨分化能力具有促进作用。

RUNX2在成骨细胞成熟的过程中起重要作用,它能调控多种因子(如OSX、FGFR2、FGFR3等),以此诱导成骨细胞的分化[15];OSX作为RUNX2的下游蛋白,可一同影响成骨细胞的分化[16]。本研究中,祛湿健骨方与地塞米松共同干预的细胞,其OSX与RUNX2的表达高于地塞米松组的细胞,可以推测出祛湿健骨方通过提高RUNX2、OSX蛋白的表达水平,促进成骨细胞的形成与成熟。

目前针对OP的治疗以西药为主[17]。近年来,中医药的研究显示出其对防治OP的独到之处。实验证明,固本活血壮骨颗粒可拮抗糖皮质激素性骨质疏松症,减少骨质丢失[18]。淫羊藿也被证实拥有增殖成骨细胞的能力[19]。地塞米松在骨内环境中致使成骨细胞分化能力被抑制,成骨功能受损明显,而祛湿健骨方可能通过提高RUNX2蛋白的表达,从而调控OSX表达提高,诱导前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化,有效缓解地塞米松造成的成骨细胞损伤。本研究证实了祛湿健骨方对成骨细胞分化能力具有促进作用,推测其可能通过提升RUNX2和OSX蛋白的表达来促进成骨细胞的成熟。但本实验研究对象仅限于MC3T3-E1细胞的成骨分化能力;后续研究中,可增加祛湿健骨方对破骨细胞分化能力的探索,以期为祛湿健骨方防治OP提供理论依据。