麦尔哈巴·麦麦提艾力, 许少全, 李 婧, 刘 辉, 周 润, 夏衣旦木·吐尼牙孜,赵金龙, 吕国栋,,3

(1新疆医科大学药学院, 乌鲁木齐 830017; 2新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院;3省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室, 乌鲁木齐 830054)

对乙酰氨基酚(Acetaminophen, APAP)是一类非甾体类抗炎药,具有镇痛、解热的功效,于20世纪50年代被批准用于临床,可用于缓解感冒引起的高热以及缓解轻至中度的疼痛症状[1],是全球新冠疫情大流行环境中最为常用的药物之一[2]。APAP在推荐剂量下是安全有效的,但长期或过量使用对乙酰氨基酚会引发肝损伤,导致肝功能衰竭,更严重的会导致死亡[3-4]。毛果芸香碱是毒蕈碱乙酰胆碱受体m3(Muscarinic acetylcholine receptor m3, m3AchR)激动剂,其能通过直接结合和激活毒蕈碱受体发挥作用[5]。研究发现,毛果芸香碱通过激活m3AchR对CCl4及偶氮甲烷所致的小鼠肝损伤具有保护作用[6]。Khurana等[7]报道,在偶氮甲烷所致小鼠肝损伤模型中,毛果芸香碱能通过激活m3AchR-细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases1/2, ERK1/2)信号通路来促进细胞增殖,以减轻肝损伤。Kajiya等[8]研究报道,表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor, EGFR)反式激活连接m3AchR,启动下游的信号通路,如RAS/MAPK和PI3K/AKT等,参与细胞的增殖、迁移和存活等过程。在多种组织损伤和修复过程中,ERK1/2信号通路的激活对于肝细胞增殖起着关键的调节作用,当ERK1/2信号通路激活后,发生核转位,并通过影响转录因子的活性,调控相关基因的表达,从而促进肝细胞增殖[9]。本研究通过建立APAP肝损伤小鼠模型,探究毛果芸香碱减轻对乙酰氨基酚所致肝损伤的药效及作用机制,现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 18只C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司,8～10周龄,体重18～20 g。小鼠在新疆医科大学动物实验中心IVC屏障环境中饲养,自由摄取食物和水。

1.1.2 试药 对乙酰氨基酚(美国MedChemExpress公司, HY-66005);毛果芸香碱(美国MedChemExpress公司, HY-B0726);Anti-GAPDH抗体(英国Abcam公司, ab181602);ERK1/2抗体(美国CST公司, 4695)、p-ERK1/2抗体(美国CST公司, 4370S)、PCNA抗体(美国CST公司, 13110)。

1.2 分组及给药实验动物适应性喂养7 d,按照随机分配原则将18只C57BL/6小鼠分为空白对照组、APAP模型组、毛果芸香碱组,每组6只。毛果芸香碱组小鼠腹腔注射毛果芸香碱(2.5 mg/kg体重)7 d[7,10],空白对照组和APAP模型组注射等量生理盐水,第7天3组小鼠禁食不禁水过夜24 h,末次给药毛果芸香碱1 h后,毛果芸香碱组及APAP模型组腹腔注射APAP(400 mg/kg体重),空白对照组腹腔注射等量生理盐水。APAP注射12 h后处死所有小鼠,采集血液和肝脏等组织样本。在生理盐水中冲洗肝脏,并在4%多聚甲醛中固定,一部分在液氮中快速冷冻,备用。

1.3 血清生化指标、肝脏病理、PCNA、ERK1/2蛋白水平的测定

1.3.1 肝脏病理染色 将3组小鼠处死后,采集肝脏组织置于4%多聚甲醛中固定,48 h后取出,经梯度乙醇和二甲苯脱水透明后,用石蜡包埋,将蜡块经手动切片机切成4 μm厚度,连续切片,将切片放入60℃烤箱过夜后取出,用二甲苯脱蜡,苏木素及伊红进行染色,在光学显微镜下观察并采集图像。

1.3.2 血清AST、ALT水平的测定 空白对照组、APAP模型组、毛果芸香碱组小鼠在处死前,使用一次性注射器对小鼠心脏采血0.7 mL,室温放置30 min后,3 000 r/min低温离心30 min分离血清,采用迈瑞BS-240Y血清生化检测仪检测各组小鼠血清中天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase, AST)和丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase, ALT)的水平。

1.3.3 肝脏PCNA、ERK1/2及p-ERK1/2蛋白水平的测定 3组小鼠各取3例肝脏样本,称取20～30 mg肝脏组织,加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液后用研磨仪对肝脏组织进行研磨打碎,在冰上静置30 min使组织裂解充分,12 000 r/min离心15 min,取上清液,采用BCA法对提取的总蛋白进行定量后,加入上样缓冲液在100℃煮蛋白10 min,使蛋白变性。将蛋白上样于制备好的SDS-PAGE胶,电泳完成后电转至 PVDF膜上,经5%脱脂奶粉封闭2 h后,分别加入稀释后的一抗溶液,GAPDH(1∶10 000),ERK1/2(1∶1 000),p-ERK1/2(1∶2 000),PCNA(1∶1 000),在4℃冰箱孵育过夜。次日经TBST洗膜3次,加入相应二抗(稀释比例为1∶5 000)室温孵育1 h后,加入ECL化学发光底物试剂盒进行显影拍照。使用Image J软件对条带灰度值进行统计分析。

2 结果

2.1 各组小鼠肝脏病理变化的比较HE染色病理学结果显示,空白对照组肝细胞索排列规整,肝细胞大小无异常,如图1A所示;APAP模型组肝细胞结构异常,白色箭头指向区域出现肝小叶中心坏死、肝内出血和细胞核消失或固缩,如图1B所示;毛果芸香碱组APAP诱导的小鼠肝毒性减少,白色箭头指向表示,与APAP模型组比较,肝内出血、核固缩和肝细胞死亡减少,如图1C所示。

(注: A为空白对照组; B为APAP模型组; C为毛果芸香碱组。)

2.2 各组小鼠血清ALT和AST水平的比较与空白对照组比较,APAP模型组小鼠血清ALT和AST水平均升高,差异有统计学意义(P<0.001)。与APAP模型组比较,毛果芸香碱组小鼠血清AST水平降低,差异有统计学意义(P<0.01),见表1。

表1 各组小鼠血清ALT和AST水平的比较

2.3 各组小鼠肝脏PCNA蛋白表达水平的比较与空白对照组比较,APAP模型组小鼠肝脏PCNA蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05),毛果芸香碱组小鼠肝脏PCNA蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01);与APAP模型组比较,毛果芸香碱组小鼠肝脏PCNA蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.01),见表2、图2。

表2 各组小鼠肝脏PCNA蛋白表达水平的比较

图2 各组小鼠肝脏PCNA蛋白电泳图

2.4 各组小鼠肝脏ERK和p-ERK蛋白表达水平的比较与空白对照组比较,APAP模型组小鼠肝脏p-ERK/ERK蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05),毛果芸香碱组小鼠肝脏p-ERK/ERK蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.01);与APAP模型组比较,毛果芸香碱组小鼠肝脏p-ERK/ERK蛋白水平升高,差异有统计学意义(P<0.01),见表3、图3。

表3 各组小鼠肝脏ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达水平的比较

图3 各组小鼠肝脏ERK和p-ERK蛋白电泳图

3 讨论

APAP作为常用的退热镇痛药,多用于治疗病毒感染患者, APAP中毒是导致药物性肝损伤的主要原因[11]。本研究发现毛果芸香碱能够减轻APAP中毒小鼠的肝细胞损伤,促进APAP致肝损伤小鼠的肝细胞增殖,这种肝细胞增殖现象是毛果芸香碱激活m3AchR-ERK1/2信号通路来调控的。

本研究通过检测 APAP所致肝损伤小鼠血清肝功水平和肝脏病理发现,毛果芸香碱降低了小鼠血清中AST水平,显著改善了小鼠肝脏的病理结构,表明毛果芸香碱可减轻APAP肝脏损伤。在偶氮甲烷所致小鼠肝损伤模型中,毛果芸香碱减轻了肝纤维化和胶原沉积,减少肝细胞凋亡和氧化应激,同时增加了肝细胞增殖[7]。Zhang等[6]研究发现,毛果芸香碱减轻了CCl4诱导的小鼠肝细胞AML12损伤并促进AML12增殖,同时减轻了CCl4所致小鼠的肝脏损伤程度。毛果芸香碱与卡巴胆碱联合治疗可显著减少肝脏脂质积聚,对脂肪性肝病具有保护作用[12]。有研究报道,毛果芸香碱通过改善迷走神经重构来缓解心肌梗死症状[13],提示毛果芸香碱不仅在APAP致肝损伤具有促进组织修复作用,还可以促进化学性肝损伤和脂肪性肝病的组织修复,减轻其他脏器损伤。

毛果芸香碱是m3AchR激动剂,通过激活M胆碱受体发挥作用。m3AchR是组织损伤修复中的热门靶点,是胆碱能神经信号传递的重要成员,活化后介导多种细胞反应,具有调控胰岛素分泌、钙离子调节和器官发育和再生等功能[14]。胆碱能神经元参与调节肝损伤,m3AchR的激活可以调节肝细胞功能[15]。有研究报道,m3AchR基因敲除使偶氮甲烷诱导的小鼠肝损伤严重加剧[7],表明选择性激活m3AchR可以预防或减少肝损伤,提示m3AchR是APAP致肝损伤的药物靶点。

本研究中发现毛果芸香碱可激活p-ERK信号通路,促进肝细胞增殖。p-ERK信号通路激活后可以直接或间接地通过调节PCNA蛋白水平来影响DNA复制和细胞增殖,促进APAP所致肝损伤小鼠肝细胞的增殖。肝脏再生能力减弱会加速APAP过量后肝细胞的损伤和死亡,因此增强APAP所致肝损伤后的肝脏再生极为关键[16]。Khurana等发现,毛果芸香碱活化m3AchR进而激活p-ERK信号通路促进肝细胞增殖[7]。同时对偶氮甲烷所致肝损伤有保护作用,表明激活m3AchR可以通过涉及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族的途径改变基因转录[17]。ERK是MAPK家族关键成员,MAPK/ERK作为目前最经典的信号转导通路之一,可将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内,引起细胞增殖、分化等一系列生物学反应[18]。PCNA在细胞周期的G1期和S期晚期合成,并与细胞增殖状态相关,PCNA在多种细胞生物学过程中发挥着重要作用,如DNA复制和修复、染色质重塑、染色体分离和细胞周期进展[19]。PCNA在DNA复制中起到关键的作用,被认为是最典型的细胞增殖标记物[20]。提示毛果芸香碱通过ERK信号通路发挥促APAP肝损伤中肝细胞的增殖作用。

综上所述,本研究表明毛果芸香碱通过激活m3AchR-ERK信号通路促进APAP诱导的急性肝损伤后肝细胞的增殖,减轻APAP所致肝损伤,为研发新型治疗APAP所致肝损伤的潜在药物奠定了研究基础。