林雨昕, 柏如海, 陈昳璠, 吴荣谦, 王海容, 杜肇清1,

(1陕西人民医院肝胆外科, 西安 710068; 2上海交通大学医学院, 上海 200025; 3南京理工大学公共关系学院, 南京 210094;4北京大学医学院, 北京 100191; 5西安交通大学第一附属医院精准外科与再生医学国家地方联合工程研究中心, 西安 710061;6西安交通大学精密工程研究所, 西安 710049)

他克莫司(Tacrolimus)是一种广泛应用于临床器官移植术后的免疫抑制剂,由于治疗窗较窄,药物浓度个体差异较大,药物副作用大,如肾功能损害、神经系统症状及胃肠道反应等,因此对其血药浓度的监测非常重要[1]。目前临床对患者他克莫司血药浓度监测的方法为免疫分析法和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。免疫分析法包括:化学发光酶免疫测定(CLIA)、电化学发光免疫测定(ECLIA)、亲和柱介导免疫测定(ACMIA)、酶扩大免疫测定技术(EMIT)、Dimension TAC测定和V-twin系统等[2-3]。但这些方法定量分析步骤复杂,操作困难。LC-MS/MS法作为他克莫司检测的金标准,由于技术要求高、检测成本昂贵、需要多步骤预处理等,在临床中无法广泛应用[4]。表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced raman spectroscopy,SERS)具有分子指纹识别、检测成本低、检测方法便捷等优势,近年来在临床化疗药物及免疫抑制剂血药浓度监测中被广泛研究。本研究建立基于第五代KlariteTM芯片SERS快速检测生理溶剂及血清溶液中他克莫司药物浓度的方法,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂他克莫司胶囊(安斯泰来制药有限公司,H20130235,0.5 mg);丙酮(意大利Sigma Aldrichgong公司);磷酸盐缓冲(PBS)溶液(意大利Sigma Aldrich公司,pH 7.4);牛血清(BSA)白蛋白(武汉谷歌生物公司,36101ES25,25 g);人血清白蛋白标准溶液(武汉谷歌生物公司,S24985,10 mL)。

1.2 芯片镀金的第五代SERSKlariteTM芯片(英国Mesophotonics 有限公司),芯片参数:节距长度1 250 nm,凹坑尺寸1 000 nm,矩形纵横比1∶1.2,聚甲基丙烯酸甲酯塑料基底厚度0.5 mm,尺寸8 mm×8 mm,表面沉积金厚度400 nm,标准角度25°。

1.3 溶液的配置

1.3.1 他克莫司丙酮溶液和水溶液的配置 取他克莫司粉末,加入丙酮溶液,配置成浓度为50 μg/mL的他克莫司丙酮溶液。取0.5 mg他克莫司粉末溶解在0.2 mL甲醇中,用蒸馏水定容至10 mL,得到初始浓度为50 μg/mL的他克莫司水溶液,按比例配置成浓度分别为0.1、0.6、1.2、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0和50.0 μg/mL的他克莫司标准溶液,备用。

1.3.2 他克莫司PBS溶液的配置 取0.5 mg他克莫司粉末溶解在0.2 mL甲醇中,用PBS溶液定容至10 mL,得到初始浓度为50 μg/mL的他克莫司PBS溶液,按比例配置成梯度浓度分别为0.1、0.6、1.2、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0和50.0 μg/mL的他克莫司PBS标准溶液,备用。

1.3.3 他克莫司模拟血清溶液的配置 取4 g的BSA溶解在100 mL PBS溶液中,得到4%的BSA-PBS溶液;取20 mL人血清白蛋白标准溶液按体积比1∶4溶解于80 mL PBS溶液,得到人血清样品检测的溶剂。取0.5 mg他克莫司粉末溶解在0.2 mL甲醇中,用BSA-PBS溶液将按比例稀释的人血清溶液定容至10 mL,得到浓度为50 μg/mL的他克莫司BSA-PBS溶液或人血清溶液。

1.3.4 溶液的储存及检测 将所有配置溶液保存在生理pH值(7.4),4℃环境存放。检测时,将1.5 μL药物溶液滴涂在 KlariteTM金字塔纳米结构表面,室温下风干2 h。

1.4 指标测定

1.4.1 他克莫司粉末及丙酮溶液拉曼光谱的测定 取他克莫司粉末及丙酮溶液采用MS20型拉曼光谱仪(英国雷尼绍有限公司),激光功率为1 mW,积分时间为10 s,测定785 nm处的SERS信号,积累2次,使用50×物镜,采用WiRE 3.1软件收集拉曼光谱数据。每个样品在SERS基底液滴区域随机选择6个采集点,取平均值作为最终信号值。为获取较为纯净的拉曼光谱,所有收集的波长数值在300～1 700 cm-1范围内,对不可避免的系统噪点,拉曼谱带位置的再现性在±2 cm-1内有效。

1.4.2 他克莫司水溶液及PBS溶液拉曼光谱的测定 取“1.3.1”项下他克莫司水溶液和“1.3.2”项下他克莫司PBS溶液各1.5 μL,分别滴涂在KlariteTM芯片表面,室温下风干2 h,按“1.4.1”项下光谱条件,测定785 nm处的SERS信号,积累6次。采用WiRE 3.1软件收集拉曼光谱数据,对所有采集到的光谱信息进行归一化分析和记录。

1.4.3 蒸馏水溶液中他克莫司浓度检出限的测定 取“1.3.1”项下他克莫司水溶液按“1.4.2”项下方法,测定蒸馏水溶液中他克莫司浓度的检出限,绘制标准曲线,计算回归方程。采用检出限(Limit of detection,LOD)和定量限(Limit of quantification, LOQ)评估芯片对药物的检测能力。LOD作为可检出的最低药物浓度,由3倍的信噪比(Signal-to-noise, S/N)表示,LOQ为S/N的10倍。

1.4.4 PBS溶液中他克莫司浓度检出限的测定 取“1.3.2”项下制备的他克莫司标准PBS溶液,按照“1.4.2”项下方法,测定PBS标准溶液中他克莫司浓度的检出限,绘制标准曲线,计算回归方程。采用LOD和LOQ评估芯片对他克莫司的检测能力。

1.4.5 血清溶液中他克莫司的拉曼光谱测定 取“1.3.3”项下制备浓度为50 μg/mL的他克莫司BSA-PBS溶液或人血清溶液,按照“1.4.2”项下方法,测定他克莫司的拉曼光谱,每个点表示来自每个KlariteTM基底3个随机SERS光谱的平均值。

1.5 数据分析采用Origin 2017软件对拉曼光谱数据做基线化和标准平滑处理,进行预处理和峰比较,获取峰值定位、线性结果和光谱展示图。使用Graphpad prism 8.0软件对线性结果及光谱展示图进行美化。采用理论拉曼光谱图与粉末拉曼光谱图比对,对谱峰归属进行指认。

2 结果

2.1 他克莫司粉末及他克莫司丙酮溶液拉曼光谱的测定拉曼光谱显示他克莫司粉末在354～396、474、851～917和1 088 cm-1处出现尖峰,在1 265～1 475 cm-1处出现宽峰;他克莫司丙酮溶液在354、475、1 090 cm-1处出现尖峰,在854～917、1 265 cm-1处出现宽峰,见图1。

(注: a为他克莫司粉末的拉曼光谱; b为他克莫司丙酮溶液的拉曼光谱; c为作为参考背景的空KlariteTM基底的拉曼光谱。)

2.2 滴涂沉积法(DCDR)测定他克莫司溶液显微镜观察他克莫司水溶液和PBS溶液沉积在KlairteTM芯片表面的“咖啡环”,见图2、3。拉曼光谱显示KlariteTM上涂滴沉积的光谱“咖啡环”的外边缘和中心区域显示出非常一致的特征峰,在354、474、851～917和1 088 cm-1处出现尖峰,在1 265、1 337和1 475 cm-1处出现宽峰,见图4、5。

图2 显微镜下他克莫司水溶液的“咖啡环”图(50×透镜)

图3 显微镜下他克莫司PBS溶液的“咖啡环”图(50×透镜)

(注:a为他克莫司粉末的拉曼光谱; b和c为50 μg/mL他克莫司水溶液在“咖啡环”上的点i处分别使用60 s和20 s信号积分;d为50 μg/mL他克莫司水溶液在“咖啡环”上的第二点使用20 s信号积分;e为50 μg/mL他克莫司水溶液在裸金表面上使用20 s信号积分;f为水溶液在KlariteTM上使用20 s信号积分。)

(注:a为他克莫司粉末的拉曼光谱;b和c为50 μg/mL他克莫司PBS溶液在“咖啡环”上的点i处分别使用60 s和20 s信号积分;d为50 μg/mL他克莫司PBS溶液在“咖啡环”上的第二点使用20 s信号积分;e为50 μg/mL他克莫司PBS溶液在裸金表面上使用20 s信号积分;f为PBS溶液在KlariteTM上使用20 s信号积分。)

2.3 他克莫司水溶液中浓度检出限的测定与他克莫司粉末的拉曼光谱比较,他克莫司梯度水溶液中鉴定处的峰没有显示出明显位移,在354、476、854、879、1 091、1 268和1 461 cm-1处出现尖峰,谱峰强度与浓度存在线性关系,见图6。取354 cm-1处的特征峰作为研究对象,在选定的标准浓度区间内回归方程为:Y=52.86X+596.5,峰的测定系数(R2)为0.890 5,LOD为0.14 μg/mL,LOQ为0.47 μg/mL,见图7。

图6 他克莫司水溶液的拉曼光谱图

图7 他克莫司水溶液中药物浓度与拉曼光谱峰强度的标准曲线

2.4 他克莫司PBS溶液中浓度检出限的测定与他克莫司水溶液的拉曼光谱比较,特征峰变宽变弱,而且位置也略有偏移,在350、478、850、1 077、1 126、1 269和1 464 cm-1处产生尖峰,谱峰强度与浓度趋势存在线性关系,见图8。取350 cm-1处的特征峰作为研究对象,标准浓度区间内获取的线性方程为:Y=19.54X+537.8,峰的测定系数(R2)为0.2176,LOD为2.5 μg/mL,LOQ为8.3 μg/mL,见图9。

图8 他克莫司PBS溶液的拉曼光谱图

图9 他克莫司PBS溶液中药物浓度与拉曼光谱峰强度的标准曲线

2.5 他克莫司血清溶液拉曼光谱的测定与他克莫司水溶液和PBS溶液的拉曼光谱比较,血清溶液中他克莫司的拉曼信号较弱,高浓度时能检测到他克莫司的部分特征峰,主要分布在352、488、855、1 135、1 213和1 456 cm-1处,这些峰的强度均明显减弱,且发生不同程度的频率偏移,见图10。

3 讨论

作为一种快速、简单、经济的方法,表面增强拉曼光谱(Surface-enhanced raman spectroscopy,SERS)已被用于各种抗癌药物和生物标志物分析和定量监测[5-7]。他克莫司胶囊粉末的拉曼光谱信号与他克莫司软膏、他克莫司TiO2化合物等类似原料药物的拉曼光谱信号不完全一致,但多个主要峰高度接近。光谱的差异归因于胶囊中的4种非活性成分,尽管辅料会导致不同的拉曼光谱强度值和带移,但不会影响他克莫司的检测和识别。以丙酮作为溶剂时,丙酮受到芯片表面的强金属吸附作用容易分散,导致光谱信号不稳定性且灵敏度较低,但在液体滴涂区域仍可检测到他克莫司的特征峰。

与普通拉曼信号比较,SERS的信号可增强106～108倍[8]。利用SERS纳米基底产生的表面等离子体共振效应,信号能够增强1010～1014倍,可获得单分子指纹图谱[9]。KlariteTM芯片作为一款优秀的具有倒置四棱锥金字塔矩阵的商用SERS芯片,已经展现出高度稳定和可再现的SERS信号[10]。研究发现不同的KlariteTM纵横比能够显著增强SERS的信号,与标准KlariteTM芯片相比,节距为1 250 nm、凹坑尺寸为1 000 nm、纵横比为1∶1.2的第五代SERS KlariteTM芯片增加了786%的SERS计数(约8倍),表现出更好的再现性[11]。

国内外多项研究报道利用SERS基底实现了对低浓度生物分子或蛋白质的滴涂沉积拉曼(Drop coating deposition Raman, DCDR)检测方案,如胰岛素、耐药肺炎克雷伯菌株[12]、结直肠癌患者血浆蛋白[13]、糖基化血红蛋白[14]、骨关节炎患者滑液[15]等。DCDR是将分析物直接滴涂在SERS基底表面,使用拉曼光谱系统评估风干后残留“咖啡环”轮廓的检测方法。研究发现,经过合理的预处理和标定,DCDR即使在含有荧光基质或复杂缓冲成分的混合物中,也是一种有效的表面分析法[16]。与他克莫司粉末拉曼光谱比较,他克莫司水溶液经过DCDR处理,SERS光谱中鉴定出的峰没有显示出明显的位移,表明他克莫司药物分子对金表面的作用较弱。与蒸馏水溶液中他克莫司拉曼光谱比较,PBS沉积液滴的SERS光谱显示他克莫司的特征峰形状和位置均发生一定改变,这与PBS缓冲液中存在大量离子,影响了他克莫司药物分子与金膜的结合有关。

综上所述,于KlariteTM芯片表面增强拉曼光谱法第五代SERS KlariteTM芯片进行滴涂沉积有望成为一种快速便捷地测定免疫抑制剂他克莫司药物浓度的方法。本研究中,确定了他克莫司胶囊粉末的拉曼光谱和特征峰,KlariteTM纳米结构在蒸馏水和PBS溶液中均以极低检出限展示出足够的反应性,可以清晰地捕获药物的特征峰,仍然无法获得低于LOQ的信号强度和药物浓度之间的精确线性关系。此外,即使在蒸馏水等单组分溶液中,第五代SERS KlariteTM芯片对他克莫司的LOD值也比临床检测需求低约2个数量级,距离临床应用还有差距。作为未来他克莫司浓度监测的有效方案,在传感器微观结构优化和基于新一代SERS KlariteTM芯片的生物样本检测方面,仍需要进行进一步的研究。