谭菊英，刘庄蔚，何 虹，蒋 洁，杨欣智，吴明珍，朱健萍，邓 鸣

（广西壮族自治区食品药品检验所，广西南宁 530021）

口服五维赖氨酸葡萄糖收载于《化学药品地方标准上升国家标准》第五册［1］，主要成分有葡萄糖、盐酸赖氨酸、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酰胺、泛酸钙。该品适用于贫血、肝炎等慢性病所致营养不良，葡萄糖补充热量、治疗低血糖症，盐酸赖氨酸维持肌体氮平衡，促进蛋白质的合成和代谢，促进人体生长发育及智力发育，维生素B1维持心血管系统、神经系统及消化系统的正常功能，维生素B2维持红细胞完整性，维生素B6促进蛋白质代谢［1］。此外，泛酸钙参与碳水化合物等的代谢［2-3］，烟酰胺与蛋白质的代谢及儿童智力发育关系密切，并可维持皮肤和消化器官的正常功能［4］。现行质量标准仅测定了方中葡萄糖的含量。为此，本研究中参考文献［5-13］，建立了同时测定制剂中6 种成分含量的高效液相色谱（HPLC）法，为其质量控制提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT 型HPLC 仪，包括二极管阵列检测器、四元泵等（日本Shimadzu 公司）；XS205 型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度为0.01 mg）；9983 型超声仪（宁波海曙科生超声设备有限公司）。

1.2 试药

5 批口服五维赖氨酸葡萄糖样品及混合空白辅料（葡萄糖、蔗糖、蜂乳的混合物）均源于某企业；泛酸钙对照品（批号为100369 - 201905，按C17H20N4O6计含量为96.8%），烟酰胺对照品（批号为100115 - 202005，按C6H6N2O 计含量为99.9%），维生素B6对照品（批号为100116 - 201906，按C8H11NO3·HCl 计含量为99.9%），盐酸赖氨酸对照品（批号为140673 - 202010，按C6H14N2O2·HCl 计含量为99.9%），维生素B2对照品（批号为100369-201905，按C17H20N4O6计含量为98.2%），维生素B1对照品（批号为100390 - 201806，按C12H17ClN4OS·HCl 计含量为97.9%），均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：5 mmol/ L 庚烷磺酸钠溶液（用20%磷酸水溶液调pH 至2.5，A）- 乙腈（B），梯度洗脱（0～45 min 时95%A →77%A，45～57 min 时77%A，57～58 min 时77%A →95%A，58～65 min时95%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：200 nm（泛酸钙、盐酸赖氨酸），261 nm（烟酰胺、维生素B2、维生素B1），290 nm（维生素B6）；柱温：40 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取各对照品适量，以0.1%磷酸水溶液溶解，制成泛酸钙、烟酰胺、维生素B6、盐酸赖氨酸、维生素B2、维生素B1质量浓度分别为58.72，210.99，26.03，1 044.00，21.39，83.80 μg/ mL 的混合对照品贮备液。精密量取2 mL，置10 mL 容量瓶中，用0.1%磷酸水溶液定容，摇匀，即得。

供试品溶液：取10包样品内容物，混匀，研细，取约2 g，精密称定，置10 mL 容量瓶中，加入0.1%磷酸水溶液6 mL，超声（功率250 W，频率45 kHz）振摇使溶解，放冷至室温，用0.1%磷酸水溶液定容，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

辅料溶液：取混合空白辅料适量，按供试品溶液制备方法制备，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下3种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果辅料溶液色谱图中，在与混合对照品溶液色谱图相同保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。详见图1。

1. 泛酸钙 2. 烟酰胺 3. 维生素B6 4. 盐酸赖氨酸5. 维生素B2 6. 维生素B1a. 混合对照品溶液 b. 供试品溶液 c. 辅料溶液A.200 nm B.261 nm C.290 nm图1 高效液相色谱图1.Calcium pantothenate 2.Niacinamide 3.Vitamin B6 4.Lysine hydrochloride 5.Vitamin B2 6.Vitamin B1a.Mixed reference solution b.Test solution c.Adjuvant solutionA.200 nm B.261 nm C.290 nmFig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.2项下混合对照品贮备液0.2，0.5，0.7，1.0，1.6，2.0，3.0，4.0 mL，置10 mL容量瓶中，加0.1%磷酸水溶液定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液，各精密量取20 μL，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表1。

表1 线性关系考察结果（n=8）Tab.1 Results of the linear relation test（n = 8）

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果泛酸钙、烟酰胺、维生素B6、盐酸赖氨酸、维生素B2、维生素B1峰面积的RSD分别为0.13%，0.05%，0.11%，0.30%，0.08%，0.06%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2 项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，4，8，12，18，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果泛酸钙、烟酰胺、维生素B6、盐酸赖氨酸、维生素B2、维生素B1峰面积的RSD分别为0.16%，0.10%，0.58%，1.00%，0.19%，0.23%（n= 6），表明供试品溶液室温下放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取样品内容物适量，精密称定，各6份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果泛酸钙、烟酰胺、维生素B6、盐酸赖氨酸、维生素B2、维生素B1含量的RSD分别为1.10%，0.41%，0.57%，1.77%，0.24%，0.70%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的样品适量，共6份，分别加入一定质量浓度的待测对照品溶液，按2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n = 6）

2.4 样品含量测定

取5 批样品各适量，分别按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，并计算样品含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果（%，n=3）Tab.3 Results of the content determination of six components in samples（%，n = 3）

3 讨论

制剂中6 种待测成分均为水溶性，且部分极性较大，在色谱柱中保留较弱，故参考文献［6］以庚烷磺酸钠作为离子对试剂，增强了各物质的保留。预试验中比较了2，5，10 mmol / L 庚烷磺酸钠的分离效果，结果5 mmol/ L 时的保留时间适中；比较了流动相pH 为7.2，4.2，3.1，2.5的分离效果，发现pH为7.2时，各待测成分色谱峰为帆状，泛酸钙色谱峰保留时间仅2.8 min；在pH 由4.2 调至3.1，再调至2.5 的过程中，各峰对称性变好，泛酸钙保留时间延长，维生素B6和维生素B2出峰顺序发生变化（pH 为4.2，2.5 时维生素B6在前，pH 为3.1时维生素B2在前），当pH为2.5时，各峰峰形及分离度均最优，可见pH 为2.5 时各待测成分以单一成分存在［12］。

经二极管阵列检测器采集混合对照品溶液色谱图后，提取待测成分的紫外图谱，结果盐酸赖氨酸、泛酸钙无最大吸收（仅为末端吸收），烟酰胺、维生素B6、维生素B2、维生素B1的最大吸收波长分别为261，290，267，246 nm；维生素B1、维生素B2在261 nm波长处的响应值均约为最大吸收波长处响应值的95%。由于各成分的浓度及响应相差较大，选择多波长检测以快速简捷地同时测定6种成分含量。

本品除盐酸赖氨酸外的其他5 种成分含量均在处方量的90.0%～110.0%，盐酸赖氨酸含量稍偏低，推测原因为本品含具有还原性的葡萄糖，而盐酸赖氨酸含有氨基，两者可在湿热条件下发生美拉德反应［14-15］，导致此类化合物含量减少，加之该企业使用的生产工艺为湿法制粒、热风干燥，为美拉德反应提供了条件，故认为盐酸赖氨酸含量偏低的原因可能为发生了美拉德反应，建议企业加以重视。

综上所述，本研究中所建立的方法专属性好，结果准确，能有效测定口服五维赖氨酸葡萄糖中6种成分的含量，且该方法有效弥补了现行质量标准的缺陷，可用于该产品的质量控制。