陈俊峰，王明刚，桂雄斌

广西中医药大学第一附属医院耳鼻喉科，南宁 530000

变应性鼻炎（AR）是一种常见变态反应性疾病，是由特异性免疫球蛋白E（IgE）介导的鼻黏膜慢性炎症反应，以发作性喷嚏、鼻溢、鼻塞、鼻痒等为典型临床症状［1-2］。目前AR 的常规治疗方法包括药物治疗、免疫治疗及手术治疗［3］，在此基础上还有单克隆抗体治疗及间充剂干细胞等新兴疗法［4］，但一线用药无法有效降低复发率，免疫治疗依从性较差，手术治疗接受率低，新兴疗法运用到临床还需较长时间。深入认识AR 的相关机制，从而形成有效的防治策略具有重要意义。肠道微生态是以肠道菌群为主要成分的自平衡系统，与多种免疫损伤性疾病密切相关。多项研究表明，AR的发生发展与胃肠道微生态的改变有关［5-9］。AR 在中医学上被称为鼻鼽或齁嚏［10］。本课题组认为，体质差异导致的肺脾气虚，易受外邪侵扰，邪气淤积终至气机受阻于鼻窍是AR的病因机制。根据气窍一体理论，结合脾主运化中医基础，课题组提出健脾中药补气通窍方。通过前期研究观察发现，补气通窍方能有效缓解AR 患者鼻炎症状，且总有效率高于对照组［11］。肠道微生态是中药复方发挥疗效作用的主要途径之一，因此课题组推测补气通窍方可能通过调节肠道微生态进而改善AR。2022 年11 月—2023 年7 月，本研究通过构建大鼠AR 模型，探讨补气通窍方对大鼠AR 症状的改善作用以及对肠道微生态的潜在调节作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要材料 SPF 级健康Wistar大鼠40只，6～8周龄，体质量约250 g，购于湖南省长沙市天勤生物技术有限公司，动物使用许可证号：SCXK（湘）2019-0014。补气通窍方中药配方颗粒剂（黄芪20 g、党参12 g、甘草12 g、苍耳子20 g、辛夷花10 g、细辛3 g、荆芥15 g、桔梗10 g、升麻10 g、柴胡10 g）由江阴天江（广州）药业有限公司提供，鼻炎康片（德众）购于广西中医药大学第一附属医院。卵清蛋白购于美国Sigma公司，β-actin、NF-κB p65抗体购于美国Affinity公司。生物显微镜购于日本奥林巴斯，测序仪、建库试剂盒NEB Next®Ultra DNA Library Prep Kit 购于美国Illumina 公司，PCR 产物纯化Universal DNA 纯化回收试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 动物分组建模与药物干预 40 只Wistar 大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、补气通窍方组及鼻炎康组，每组10 只。除对照组外，各组均根据前期造模方式［12］建立大鼠AR 模型。将卵清蛋白、氢氧化铝、生理盐水按照0.3 mg、30 mg、1 mL 的比例充分混匀，腹腔注射，2 天1 次，共注射14 d、7 次；第15 天起，大鼠两侧鼻孔各滴50 µL 10%卵清蛋白溶液（生理盐水配置），1天1次，共滴7 d、7次［13］。自第22 天起，模型组给予4 mL/d 纯净水灌胃，补气通窍方组给予补气通窍方57.55 g/（kg·d）灌胃［14］，鼻炎康组给予鼻炎康462.5 mg/（kg·d）灌胃，共灌胃7 d、7次；对照组常规喂养不灌胃。

1.3 动物行为学积分评价 各组每次灌胃结束后观察记录大鼠30 min 内抓鼻、喷嚏及流涕的症状发生情况并进行行为学评分。评分标准：30 min 内喷嚏1～3 次计1 分、4～10 次计2 分、≥11 次计3 分；抓鼻1～5 次计1 分、6～15 次计2 分、＞15 次计3 分；流涕流至鼻孔前计1 分、流出鼻孔前计2 分、涕流满面计3 分。以叠加法统计动物行为学积分，总分越高代表鼻炎症状越重。

1.4 脾脏、结肠及鼻黏膜组织样本采集 各组末次灌胃结束后禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛按3 mL/kg 剂量麻醉，以腹中线为切口暴露腹腔，腹主动脉采血，分离脾脏于冻存管中置于-80 ℃冰箱备检。剪取近直肠端结肠组织约2 cm（包含至少2 粒粪便颗粒），保存于-80 ℃冰箱备检。沿大鼠双眼眶剪下鼻骨，钳出鼻中隔，剥离鼻中隔两侧鼻黏膜组织，40 g/L多聚甲醛固定。

1.5 鼻黏膜组织病理学观察 各组鼻黏膜组织采用多聚甲醛固定12 h以上，以50%、75%、95%、100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋后切片，厚度约5 µm。常规HE 染色，显微镜下观察鼻黏膜纤毛状态、腺体的病理改变及嗜酸性粒细胞等炎症细胞的浸润程度。

1.6 脾脏组织NF-κB p65 蛋白检测 采用Western blotting 法。各组剪取少许脾脏组织并碾碎，加入蛋白裂解液充分裂解后于4 ℃离心机12 000 r/min 离心15 min 取上清液，配置BSA 标准品及BCA 工作液测定蛋白浓度。将所取蛋白变性后依次进行电泳、转膜、一抗、二抗、显色。采用BandScan 软件分析条带灰度值。

1.7 肠道菌群多样性及丰度检测 按照DNA 试剂盒说明书进行肠道内容物的细菌微生物基因组DNA 提取，将16 S rRNA 的V3～V4 区引物进行PCR 扩增后使用高通量测序仪Miseq 对其进行测序。统计各组包含的肠道菌群种类，采用偏最小二乘法判别分析法（PLS-DA）对各组肠道菌群进行判别分析；通过Beta 多样性指数基于Bray Curtis距离、Weighted Unifrac 距离及Unweighted Unifrac距离，采用无度量多维标定法（NMDS）比较各组大鼠菌群结构差异。采用线性判别分析（LEfSe）法分析比较各组肠道微生态特定菌属相对丰度的差异，设计LDA 效应值＞4 为丰度显著差异物种。去掉极端值后，统计各组乳杆菌科相对丰度并进行比较。

1.8 统计学方法 采用SPSS24.0 软件统计。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov正态性检验，呈正态分布以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素ANOVA 检验，重检验复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物行为学积分比较 模型组、补气通窍方组及鼻炎康组各时点动物行为学积分均高于对照组；灌胃2 d 后，补气通窍方组动物行为学积分均低于模型组；灌胃3 d 后，鼻炎康组动物行为学积分均低于模型组（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组动物行为学积分比较（分，）

表1 各组动物行为学积分比较（分，）

注：与对照组同时点比较，*P＜0.05；与模型组同时点比较，#P＜0.05。

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2.2 各组鼻黏膜组织病理学观察结果 对照组鼻黏膜假复层纤毛柱状上皮清晰可见，固有层无水肿、充血等病理改变；模型组鼻黏膜纤毛排列杂乱，可见纤毛脱落及倒伏现象，可见较多嗜酸性粒细胞等炎症细胞浸润，小血管明显增生扩张，腺体数量明显增加；补气通窍方组及鼻炎康组固有层黏膜较为完整，炎症细胞浸润程度较模型组减少，无明显腺体增生，鼻黏膜病理情况好转。见OSID码图1。

2.3 各组脾脏组织NF-κB p65 蛋白表达比较 对照组、模型组、补气通窍方组及鼻炎康组脾脏组织NF-κB p65 蛋白表达分别为1.00 ± 0.03、1.79 ±0.10、1.24 ± 0.11、1.33 ± 0.07，脾脏组织NF-κB p65 蛋白表达模型组＞补气通窍方组、鼻炎康组，模型组＞对照组（P均＜0.05）。

2.4 各组肠道菌群多样性及丰度比较 16 S rRNA 基因测序显示，对照组、模型组、补气通窍方组及鼻炎康组分别包含3 687、1 641、1 222、891 种菌群（OSID 码图2）。PLS-DA 分析显示，各组大鼠肠道菌群分离，存在各自独特的肠道菌群（OSID码图3）；NMDS 分析显示，各组大鼠两两比较，组间菌群结构存在差异（P均＜0.05，OSID 码图4）。LEfSe 分析结果显示，对照组中厚壁菌门及其分类下的乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属、芽孢杆菌纲富集；模型组中梭菌纲、瘤胃球菌属以及梭菌目富集；补气通窍方组中拟杆菌目、拟杆菌纲、拟杆菌门富集；鼻炎康组中密螺旋体属、螺旋体门、螺旋体纲、螺旋体目、螺旋体科以及普雷沃菌科富集；在菌属水平上，各组大鼠的肠道菌群特定菌属具有显著差异（LDA＞4，OSID 码图5）。在科水平上，对照组、模型组、补气通窍方组及鼻炎康组乳杆菌科相对丰度分别为58.35% ± 5.21%、36.57% ± 6.98%、50.76% ± 9.81%、47.06% ± 6.24%，乳杆菌科相对丰度对照组＞补气通窍方组、鼻炎康组＞模型组（P均＜0.05）。

3 讨论

中医学认为，鼻与脾脏关系密切，鼻病的发生发展与脾脏功能改变有关。在中医古籍中就有“鼻准属脾土”“脾热病者，鼻先赤”等记载，中医对AR的治疗常采用健脾益肺疗法［15］。本课题组创新性提出气虚窍阻的AR 病因机制，根据气窍一体、脾主运化的治疗思路创制中药补气通窍方。方中黄芪、甘草有益于脾肺之气；辛夷花、苍耳子在现代中医常用作治疗鼻疾病的药物，有通鼻窍之妙用；细辛、荆芥、桔梗、升麻、柴胡具有驱寒升阳的作用；加之党参、甘草的调和作用可健脾益气。鼻炎康是治疗AR 的常用药物，其治疗作用已被临床证实，因此本研究选择鼻炎康作为阳性对照药物。本研究发现，灌胃治疗过程中补气通窍组及鼻炎康组大鼠动物行为学评分总体呈下降趋势，两组大鼠由于AR 所导致的抓鼻、喷嚏等行为均得到缓解。经补气通窍方治疗的AR 大鼠鼻黏膜病理损伤优于模型组，其黏膜完整性及炎症细胞浸润程度等病理情况明显改善，改善效果与鼻炎康组基本一致，提示补气通窍方可有效减轻大鼠AR 鼻黏膜病理改变，从而改善大鼠AR 症状。

AR 是由辅助型T 淋巴细胞1（Th1）/Th2 免疫应答失衡而引发的以鼻腔黏膜Th2 免疫反应为主的变应性炎症反应，表现为大量表达Th2 细胞因子的Th 细胞、嗜酸粒细胞和肥大细胞浸润，同时引发炎症反应过程。有研究表明，TLR4/NF-κB 信号通路在AR 的发病过程中发挥重要作用［16］。作为一种转录因子，NF-κB 几乎存在于所有细胞类型中，能与细胞核内的多种基因位点结合，促进该基因的转录表达，参与炎症、免疫等生物学过程，是变态反应性疾病发生发展复杂网络结构的中心环节。NF-κB活化后，可从细胞质进入细胞核，启动一系列免疫相关反应，产生大量TNF-α、IL-4 等促炎因子，导致Th2 细胞增多并促进B 淋巴细胞的增殖分化，从而介导AR 的发生发展。NF-κB p65 是NF-κB 家族的重要成员之一，可以形成二聚体参与NF-κB 诱导过程，产生相应炎症反应，与AR 的发病联系紧密。本研究结果显示，模型组脾脏组织NF-κB p65 蛋白表达高于对照组，而经过补气通窍方治疗后，补气通窍方组脾脏组织NF-κB p65 蛋白表达较模型组降低，提示补气通窍方可能通过抑制NF-κB p65 发挥对AR 的治疗作用。

肠道菌群是定植在消化道中数以亿计的微生物，包括细菌、真菌、古菌和病毒。肠道微生态暂未被明确定义，但其具备相对量较大的生物多样性以及在某种水平上具有特定菌群的相对丰度。中医学提出脾主运化及脾胃学说，与肠道微生态联系紧密，调节肠道微生态是健脾中药的治疗本质之一，具有调节脾胃功能的中药方可纠正肠道微生态［17］。NIEWIEM 等［18］发现肠道通透性增加与包括AR 在内的过敏性疾病密切相关，适当补充益生菌改善肠道屏障功能可以降低过敏性疾病的发生率。乳杆菌是一种公认的益生菌，研究发现其具备治疗AR 的潜力，且对NF-κB p65 具有调节作用。多项研究表明，给予乳杆菌菌株可以对AR患者产生积极的影响，且尚未出现负面报道［19］。TRAPECAR 等［20］研究发现，部分乳杆菌成员可诱导触发肠上皮细胞中NF-κB p65 易位，将该信号进一步转化为吞噬细胞来促进免疫应答。KIM等［21］发现乳杆菌发酵甜菜根汁提取物可抑制脂多糖诱导的NF-κB p65 核易位，抑制NF-κB 信号通路中促炎细胞因子产生。本研究通过16 S rRNA 基因测序及PLS-DA 分析发现，各组大鼠均有各自独特的肠道菌种；NMDS 分析结果显示，各组大鼠两两相比较，组间菌群结构存在显著差异；LEfse 分析结果显示，各组大鼠的肠道菌群特定菌属具有显著差异。进一步比较各组乳杆菌科相对丰度发现，模型组乳杆菌科相对丰度较对照组降低，而经过补气通窍方治疗后乳杆菌科相对丰度较模型组上升，且补气通窍方组略高于鼻炎康组，但两者比较没有统计学差异。

综上所述，补气通窍方可改善大鼠AR 的鼻炎症状，修复鼻黏膜组织病理损伤，其机制可能与提高乳杆菌相对丰度调节肠道微生态，下调脾脏组织NF-κB p65 蛋白表达有关。本研究同时观察到，各组NF-κB p65 蛋白表达与乳杆菌科的相对丰度总体呈现负相关趋势，但其关联程度及影响机制仍需后续进一步研究。