郑竞雄，黄景涛，孙光蕊，赵宝山，梁宗英

承德医学院附属医院胸外科，河北承德 067000

食管癌是常见的消化道恶性肿瘤，其病死率高且预后较差［1］。靶向治疗的出现帮助部分食管癌患者改善了预后，但食管癌患者总体生存质量依然不够理想［2］。微小RNA（miRNA）属于非编码小RNA家族，可以通过与靶基因的非编码区域结合来激活或抑制癌症的进展［3］。研究表明，miR-203a-3p 在食管癌中表达异常，并可能通过调节靶基因表达参与食管癌的增殖、侵袭及迁移［4-5］。Survivin 是凋亡抑制蛋白家族的新成员，具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤及胚胎组织，且与肿瘤细胞的分化增殖及浸润转移密切相关［6-7］。本课题组前期研究发现，Survivin在食管癌中高表达，且与肿瘤分期、分化及淋巴结转移相关［8］。而miR-203a-3p 与Survivin 之间是否有关尚未见报道。2022 年10 月—2023 年10 月，本研究观察了miR-203a-3p 对食管癌TE-1 细胞侵袭及迁移能力的影响，并对miR-203a-3p 及Survivin 的靶向调控关系进行了分析，以期为食管癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 主要材料 食管癌细胞系TE-1、正常食管黏膜上皮细胞系HEEC 均购自广州天骏生物科技有限公司。miR-203a-3p mimic、miR-203a-3p inhibitor 及miR-203a-3p NC 购自上海雅吉生物科技有限公司；LipofectamineTM3000 Transfection Reagent 购自石家庄旺迪生物科技有限公司；miR-203a-3p、Survivin、U6、GAPDH 引物序列由广州锐博生物技术有限公司合成。

1.2 细胞miR-203a-3p、Survivin mRNA 检测 采用RT-qPCR 法。收集对数生长期的食管癌细胞TE-1及正常食管黏膜上皮细胞HEEC。采用TRIzol 法提取总RNA，逆转录合成cDNA。引物序列：miR-203a-3p上游引物5′-GGCATGGGTGCCCCGACGTT-3′，下游引物5-AGAGGCCTCAATCCATGGCA-3′；Survivin上游引物5′-GCCGGTACCATGGGTGCCCCGACG-3′，下游引物5′-GCCCTCGAGTCAATCCAGGGCAGC-3′；U6 上游引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；GAPDH 上游引物5′-CGACCACTTTGACAAGCTCA-3′，下游引物5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′。以U6 为miR-203a-3p 内参，GAPDH 为Survivin 内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-203a-3p、Survivin mRNA相对表达量。

1.3 miR-203a-3p 与Survivin 的靶向调控关系分析 采用双荧光素酶报告基因检测法。通过TargetScan 数据库预测miR-203a-3p 的潜在靶基因；将TE-1 细胞分为四部分，分别共转染Survivin-WT、Survivin-MUT 和miR-203a-3p mimic、阴性对照NC 质粒，光度计检测荧光素酶活性。

1.4 细胞分组及转染 TE-1 细胞于F12K 培养基中常规接种，置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养至对数生长期。将TE-1 细胞分为对照组、miR-203a-3p模拟组、miR-203a-3p抑制组及阴性对照组。取对数生长期的TE-1 细胞，以3 × 105/孔接种至6 孔板中，使用LipofectamineTM3000 试剂盒对细胞进行转染，miR-203a-3p 模拟组转染miR-203a-3p mimic，miR-203a-3p抑制组转染miR-203a-3p inhibitor，阴性对照组转染miR-203a-3p NC，对照组不转染。参照“1.2”的方法验证转染效率，RT-qPCR 检测显示转染效率合格。

1.5 细胞活力检测 采用MTT 法。分别于转染后2、12、24、36、48 h将各组细胞从培养箱中取出，每孔加入30 µL MTT 溶液，常温下孵育4 h 后弃上清，加入二甲基亚砜、每孔150 µL，80 r/min 摇匀，待结晶消失后，使用酶标仪检测细胞在570 nm 处的吸光度（A）值，以此表示细胞活力。

1.6 细胞迁移能力检测 采用细胞划痕实验。各组转染后24 h收集细胞接种于24孔板中，行细胞划痕实验。细胞培养至铺满孔底后，用枪头在板底部作“一”字划痕，PBS 清洗2 次后更换培养液，分别于0、48 h镜下拍照记录，测量划痕距离，其差值即为细胞迁移距离。

1.7 细胞侵袭能力检测 采用Transwell 侵袭实验。取Transwell 小室，使用制好的Matrigel 基质胶将上室包裹24 h。将转染后的细胞悬液以2 × 104/孔接种于上室，下室添加培养基500 µL，正常培养48 h 后弃培养基。无菌棉签擦拭上室未穿膜细胞，下层细胞多聚甲醛溶液固定后行结晶紫染色，倒置显微镜下随机观察并计数。

1.8 统计学方法 采用SPSS27.0 统计软件。计量资料采用Shapiro-Wilk 进行正态性检验，服从正态分布的数据以-x±s表示，两组数据比较行t检验，多组数据比较行单因素方差分析，重复测量数据行重复测量方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌细胞及正常食管黏膜上皮细胞miR-203a-3p、Survivin mRNA 表达比较 食管癌细胞及正常食管黏膜上皮细胞中miR-203a-3p mRNA 表达分别为0.36 ± 0.07、1.45 ± 0.11，Survivin mRNA 表达分别为1.25 ± 0.08、0.35 ± 0.07；食管癌细胞中miR-203a-3p mRNA 表达低于正常食管黏膜上皮细胞，Survivin mRNA 表达高于正常食管黏膜上皮细胞（P均＜0.05）。

2.2 miR-203a-3p 与Survivin 的靶向调控关系分析结果 通过TargetScan 数据库预测miR-203a-3p 的潜在靶基因，发现在Survivin 基因的3′UTR 端存在7 个连续的可以与miR-203a-3p 互补的核苷酸序列，且结合稳定性高，提示Survivin 可能为miR-203a-3p的潜在靶基因。见图1。双荧光素酶报告基因实验结果显示，共转染Survivin-WT和miR-203a-3p mimic质粒的TE-1 细胞相对荧光素酶活性低于其他细胞（P＜0.05），提示Survivin 是miR-203a-3p 的靶基因。见图2。

图1 Survivin 3'UTR与miR-203a-3p的结合位点

图2 双荧光素酶报告基因实验结果

2.3 各组细胞活力比较 培养12、24、36、48 h时细胞活力miR-203a-3p 抑制组＞对照组、阴性对照组＞miR-203a-3p模拟组（P均＜0.05）。见表1。

表1 培养不同时点各组细胞活力比较（）

表1 培养不同时点各组细胞活力比较（）

注：与对照组同时点比较，*P＜0.05。

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2.4 各组细胞迁移能力比较 对照组、阴性对照组、miR-203a-3p 模拟组、miR-203a-3p 抑制组细胞迁移距离分别为（338 ± 20）、（335 ± 22）、（112 ± 21）、（527 ± 23）µm；细胞迁移距离miR-203a-3p 抑制组＞对照组、阴性对照组＞miR-203a-3p 模拟组（P均＜0.05）。

2.5 各组细胞侵袭能力比较 对照组、阴性对照组、miR-203a-3p 模拟组、miR-203a-3p 抑制组侵袭细胞数分别为（96 ± 13）、（98 ± 12）、（46 ± 7）、（185 ±14）个；侵袭细胞数miR-203a-3p 抑制组＞对照组、阴性对照组＞miR-203a-3p模拟组（P均＜0.05）。

3 讨论

食管癌是一种恶性肿瘤，其患病率和病死率均相对较高。虽然近年来患者术后生存率略有提高，但总体预后仍有待进一步改善［9］。Survivin 是一种抗凋亡基因，与肿瘤细胞增殖和凋亡联系紧密［10-11］。根据本课题组前期对食管癌的研究发现，Survivin高表达与肿瘤分期及淋巴结转移有关［12］。miRNA 可通过阻断靶信使RNA 的翻译或降解靶基因来调控多种靶基因的转录后效应，进而影响肿瘤细胞的增殖和转移［13］。有研究发现，Survivin 在食管癌中与miR-143、miR-145 的表达具有相关性［14］，然而至今仍未明确Survivin 上游miRNA 的具体调控机制及其作用［15］。

miRNA 在癌症的诊断、治疗及预后评估方面具有至关重要的作用，有数据显示，差异表达的miRNA可能是食管癌形成和发展的主要因素之一，并可以作为食管癌的诊断及预后标志物［16-17］。研究发现，miR-203a-3p在肾癌细胞中低表达，可能通过抑制糖原合成酶激酶-3β 表达提升肿瘤细胞的增殖能力，抑制肿瘤细胞的凋亡［18］。此外，CHEN 等［19］研究发现，miR-203a-3p 在肺癌组织和细胞中低表达，且通过与LINC00342 相互作用促进肺癌细胞的恶性转化。本研究结果显示，miR-203a-3p 在食管癌TE-1细胞中表达降低，提示miR-203a-3p 可能参与了食管癌的发生发展。然而，目前尚未有研究报道miR-203a-3p能否作为上游分子调控Survivin参与食管癌的发生发展。

本研究前期通过Targetscan 数据库分析发现，Survivin 存在与miR-203a-3p 互补结合位点，miR-203a-3p可能是调控Survivin基因的上游分子。进一步进行双荧光素酶报告基因实验显示，共转染野生型Survivin 3′UTR载体能够显著降低食管癌TE-1细胞的荧光素酶活性，而共转染突变型Survivin 3′UTR载体细胞的荧光素酶活性无明显变化，提示Survivin是miR-203a-3p 的靶基因。通过人工合成miRNA 产物外源性改变miR-203a-3p 的表达，发现转染miR-203a-3p mimic 过表达miR-203a-3p 可减弱TE-1 的细胞活力，并抑制细胞的迁移和侵袭能力；而敲低miR-203a-3p 表达会使细胞活力、迁移和侵袭能力增强。

综上所述，miR-203a-3p高表达可抑制食管癌细胞的迁移和侵袭能力，其机制可能与靶向负调控Survivin 有关。上述研究结果为进一步阐明食管癌侵袭转移的分子机制提供了实验基础和理论依据，同时为食管癌的治疗提供了新的潜在靶点。