赵爱丽，崔晓敬

1 廊坊市中医医院眼科，河北廊坊 065000；2 廊坊市中医医院心血管病科

2 型糖尿病（T2DM）是临床最常见的糖尿病类型。近年来，随着居民生活习惯改变和人口老龄化加剧，我国T2DM 的患病率呈明显上升趋势。据报道，2021 年我国20～79 岁人群糖尿病患者约1.41亿人，其中90%以上为T2DM，疾病负担居全球首位［1］。糖尿病视网膜病变（DR）是T2DM 最常见的微血管并发症，也是导致T2DM 患者致盲的重要原因［2］。因此，早期预测DR 发生对减少T2DM 患者视力丧失、提高生命质量至关重要。炎症反应和氧化应激反应是DR 发生、发展的重要病理生理机制［3］。有研究报道，微小RNA（miRNA）可通过炎症反应和氧化应激反应参与DR 的发生、发展［4］。miR-497 是一种高度保守的miRNA。有学者通过miRNA 表达谱分析发现，miR-497 在DR 患者与健康人群血清中存在差异表达［5］。沉默信息调节因子4（Sirt4）是一种去乙酰化酶，能够通过调节多个信号通路抑制炎症反应和氧化应激反应［6］。但目前血清miR-497、Sirt4 水平与DR 关系的报道较少。鉴于些，本研究探讨了血清miR-497、Sirt4 水平与DR 的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2020 年1 月—2022 年6 月廊坊市中医医院收治的T2DM 患者203 例，根据《糖尿病视网膜病变国际临床分级标准》［7］，合并DR 61 例（合并DR 组）、未合并DR 142 例（未合并DR 组）。T2DM 的诊断依据《2 型糖尿病基层诊疗指南（实践版·2019）》［8］。纳入标准：①符合T2DM 诊断标准；②临床资料完整；③患者或其家属对本研究知情，并能配合检查和治疗。排除标准：①有先天性眼部疾病或眼部手术史者；②年龄＜18 岁者；③合并其他内分泌代谢疾病者；④合并重要脏器严重疾病者；⑤合并恶性肿瘤、血液系统疾病或自身免疫性疾病者；⑥近期接受激素或免疫抑制剂治疗者；⑦近3 个月内有急慢性感染者。其中，男109 例、女94 例，年龄38～86（61.03 ± 10.89）岁，BMI 18.05～32.02（25.07 ±2.96）kg/m2，中位糖尿病病程10（7，12）年。本研究经廊坊市中医医院伦理委员会批准（审批编号：2022-008-1）。

1.2 血清miR-497、Sirt4 检测 T2DM 患者入院次日采集空腹外周静脉血6 mL，待血液自然凝固后，1 500 × g 离心10 min，留取上层血清。取部分血清，采用TRIzol 法提取血清总RNA，经紫外可见分光光度计鉴定，OD260/OD280为1.8～2.0。按TaKaRa RNA PCR Kit说明将总RNA逆转录合成为cDNA。逆转录条件：38 ℃ 15 min，90 ℃ 5 s。以cDNA 为模板，按SYBR®Premix Ex Taq™说明进行PCR 扩增。引物序列由新贝（上海）生物科技有限公司设计合成。引物序列：miR-497 上游引物5'-GAAGGGCCGAAGAGCTCAAT-3'、下游引物5'-GGCTCGCAAAGTGTCTGTTG-3'，U6 上游引物5'-GACTATCATATGCTTACCGT-3'、下游引物5'-GGGCAGGAAGAGGGCCTAT-3'。PCR扩增反应结束，绘制熔解曲线，获取循环阈值（CT）数。以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算血清miR-497水平。取剩余血清，采用ELISA法检测血清Sirt4。

1.3 基因结合位点预测 通过TargetScan 数据库（https：//www.targetscan.org/vert_72/）预测miR-497基因与Sirt4基因的结合位点。

1.4 资料收集分析 收集T2DM 患者性别、年龄、BMI、糖尿病病程、吸烟史、饮酒史、血压（收缩压、舒张压）、TC、TG、HDL-C、LDL-C、空腹血糖（FPG）、糖化血红白蛋白（HbA1c）以及miR-497、Sirt4 等临床资料。比较合并DR 组与未合并DR 组上述临床资料，分析T2DM合并DR的影响因素。

1.5 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，结果比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，结果比较采用U检验。计数资料比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman 相关分析法。影响因素分析采用多因素Logistic 回归模型。预测效能分析采用受试者工作特征（ROC）曲线，曲线下面积（AUC）比较采用DeLong 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-497、Sirt4水平比较 见表1。

表1 两组血清miR-497、Sirt4水平比较

2.2 T2DM 合并DR 的危险因素分析结果 两组临床资料比较见表2。以T2DM 是否合并DR 为因变量，以年龄、糖尿病病程以及LDL-C、FPG、HbA1c、miR-497、Sirt4为自变量，纳入多因素Logistic 回归模型。结果发现，糖尿病病程延长及HbA1c、Sirt4 升高是T2DM 合并DR 的独立危险因素，而miR-497 升高则为其独立保护因素（P均＜0.05），见表3。

表2 两组临床资料比较

表3 T2DM合并DR的多因素Logistic回归分析结果

2.3 T2DM 合并DR 患者血清miR-497 水平与血清Sirt4 水平的关系 经TargetScan 数据库预测，miR-497基因与Sirt4基因启动子的3′端非翻译区存在结合位点，见图1。Spearman 相关分析显示，T2DM 合并DR 患者血清miR-497 水平与Sirt4 水平呈负相关（rs=-0.774，P＜0.05）。

图1 miR-497基因与Sirt4基因的结合位点示意图

2.4 血清miR-497、Sirt4水平对T2DM合并DR的预测价值 血清miR-497、Sirt4水平联合预测T2DM 合并DR 的AUC高于二者单独（Z分别为2.976、2.880，P均＜0.05），见表4。

表4 血清miR-497、Sirt4水平对T2DM合并DR的预测价值

3 讨论

T2DM 是临床常见的一种慢性代谢性疾病，以胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足为主要特征。DR 是T2DM 最常见的微血管并发症，是由于血糖升高造成眼底血-视网膜屏障破坏和新生血管形成而导致的视网膜结构和功能改变［2-3］，可严重影响视力，从而降低患者生活质量。目前，临床可通过玻璃体切除、激光治疗、玻璃体腔内注射药物等手段改善DR患者视力，但其视力恢复效果差强人意，部分患者复发率较高［9］。因此，早期预测DR 发生并尽早预防，对避免或延缓DR 进展和提高生活质量具有重要意义。

炎症反应和氧化应激反应在DR 发生、发展中扮演重要角色。高血糖可造成眼底毛细血管阻塞，引起眼底毛细血管炎症反应和氧化应激反应，促使病理性新生血管形成，这些新生血管管壁较薄，极易破裂出血，而管壁破裂后瘢痕组织形成又可牵拉视网膜使其破坏、脱落，从而导致视力降低甚至失明［4］。miRNA 可通过炎症反应和氧化应激反应参与DR 的发生、发展［4］。miR-497 是一种高度保守的miRNA，定位于人染色体17p13.1。ZHANG 等［10］研究发现，上调miR-497 表达能够靶向C-C 基序趋化因子配体19 抑制高糖诱导的肾细胞凋亡和炎症反应，抑制糖尿病肾病进展。FENG 等［11］研究报道，上调miR-497 表达能够靶向活化T 细胞核因子2 抑制高糖诱导的肾细胞炎症反应和氧化应激反应，抑制糖尿病肾病进展。糖尿病肾病也是T2DM 患者常见的微血管并发症之一。因此，笔者推测miR-497 也可能参与DR 的发生、发展。炎症反应和氧化应激反应介导的新生血管形成是DR 发生、发展的重要原因［3］。既往研究报道，过表达miR-497能够通过靶向抑制血管内皮生长因子（VEGF）而抑制肿瘤新生血管形成［12］。本研究结果显示，合并DR 组血清miR-497 水平低于未合并DR 组；血清miR-497 水平升高是T2DM 合并DR 的独立保护因素。结果表明，miR-497 能够参与DR 的发生、发展，其机制可能与血清miR-497 水平降低能够促进炎症反应和氧化应激反应，从而促进新生血管形成有关。VEGF 是新生血管形成的关键因子，在DR 的发生、发展中发挥重要作用；使用抗VEGF 药物能够显著改善DR 患者视力［3］。最近WANG 等［13］研究表明，上调miR-497表达能够靶向IL-3/STAT3 减轻炎症反应，抑制VEGF 释放，从而改善病理性角膜新生血管形成。进一步佐证了上述结论。

蛋白质翻译后修饰能够使蛋白质结构更复杂、功能更完善、调节更精细、作用更专一。乙酰化修饰是生物体内普遍存在的蛋白质翻译后修饰方式［14］。Sirt4 是NAD＋依赖的去乙酰化酶蛋白家族成员之一，主要定位于线粒体，能够通过去乙酰化作用抑制炎症反应和氧化应激反应。Sirt4 沉默或表达缺失可增强NF-κB 核转位和转录活性，促进炎症反应和氧化应激反应［6］。XU 等［15］研究报道，上调Sirt4表达能够抑制肾细胞中NF-κB 磷酸化，进而减轻糖尿病肾病小鼠足细胞炎症反应和凋亡。QIN 等［16］研究发现，上调Sirt4 表达能够靶向AMP 依赖的蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白，抑制氧化应激反应诱导的视网膜神经胶质细胞凋亡。本研究结果显示，合并DR 组血清Sirt4水平高于未合并DR 组；血清Sirt4水平升高是T2DM 合并DR 的独立危险因素。结果表明，血清Sirt4 水平升高能够促进DR 的发生、发展。这与上述研究结论并不一致，其原因可能是血清Sirt4 水平升高是机体的一种保护性反馈，以抑制炎症反应和氧化应激反应。最近研究报道，Sirt4 在高糖喂食的团头鲂脑、肾、脾脏、肌肉和肝脏等部位高表达［17］，在DR患者外周循环中亦显著升高［18］。

本研究经TargetScan 数据库预测发现，miR-497基因与Sirt4 基因启动子的3′端非翻译区存在结合位点；Spearman 相关分析发现，T2DM 合并DR 患者血清miR-497水平与血清Sirt4水平呈负相关。提示二者可能共同参与DR 的发生、发展，但其具体作用机制有待于进一步研究。本研究结果还发现，糖尿病病程延长和HbA1c 升高为T2DM 合并DR 的独立危险因素。究其原因，糖尿病病程越长，高糖对眼底毛细血管的损害越严重，而HbA1c 升高则表明血糖控制不佳，故DR的发生风险更高。

本研究ROC 曲线分析显示，血清miR-497、Sirt4水平单独和联合预测T2DM 合并DR 的AUC分别为0.769、0.765、0.850，血清miR-497、Sirt4 水平联合预测T2DM 合并DR 的AUC高于二者单独。结果表明，血清miR-497、Sirt4水平对T2DM合并DR均有一定预测价值，二者联合预测价值更高。

综上所述，T2DM 合并DR 患者血清miR-497 水平降低、血清Sirt4 水平升高，二者可能共同参与DR进程；血清miR-497、Sirt4水平对T2DM合并DR均有一定预测价值，二者联合预测价值更高。