水若凡 代康慧 李倩云 王丹丽 袁婷兰 李 玲 龚金炎 宋恭帅

（浙江科技大学生物与化学工程学院，浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江 杭州 310023）

贝类具有很高的营养和药用价值，含丰富的磷脂、蛋白质、长链多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）及矿物质等，具有保肝利胆、消炎解毒及预防老年人动脉硬化和心血管疾病等功效［1-2］。磷脂是细胞膜的主要组成成分，由甘油骨架和两个疏水性脂肪酸组成，如二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）等［3］。磷脂具有多种生理活性功能，如保持细胞膜的完整性、防止细胞膜过氧化、降低炎症活动和心血管疾病的风险等［4-5］。目前，磷脂提取与纯化一般采用液液萃取法与固相微萃取（solid-phase extraction，SPE）法［6］。SPE 因其高准确性、强选择性及易操作性而被广泛用于磷脂纯化［7-8］。例如，Liu 等［9］利用常规的商用二氧化硅（SiO2）SPE小柱富集人乳中的磷脂。

随着技术的发展，越来越多的新型材料被用于纯化磷脂。介孔二氧化硅（KCC-1）是一种新型的呈放射状结构的微球，具有大孔容积、高比表面积和机械强度等特点，在分离、吸附及生物医学等领域均得到较好的应用［10］。然而KCC-1 本质为SiO2，缺乏反应活性中心，在实际应用中存在一定的局限性，故需要对其进行功能化修饰来强化其性能进而拓宽应用范围［11］。对于介孔材料的功能化修饰，通常利用化学方法负载金属氧化物或非金属氧化物、引入有机官能团以及杂原子取代无机骨架等来实现［12-13］。二氧化钛（TiO2）是一种常见的金属氧化物，表面的路易斯酸-碱活性作用位点与磷酸基团（PO43-）有很强的结合力，具有吸附磷脂的能力［14-15］。氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是以sp2和sp3杂化结构连接的二维碳材料，具有较好的导热性能、较大比表面积及良好的机械强度，表面存在大量环氧基、羟基、羧基等官能团［16］。但在范德华力作用下，GO片层间易发生团聚现象从而限制其在某些领域的应用。研究发现，将GO 与生物质硅材料结合形成复合材料可充分发挥GO的优异特性［17-18］。

本研究采用微乳液法制备KCC-1 微球，并通过水蒸气内部水解法对其进行功能化修饰，分别合成TiO2/KCC-1 和GO/KCC-1 材料，再利用扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）等技术表征所制备材料的形貌结构，而后将两种新型材料作为填料制成SPE柱。以贻贝为原料，采用改良的Bligh-Dyer（B&D）法提取脂质。最后，通过建立的SPE 法结合亲水相互作用色谱与质谱（hydrophilic interaction liquid chromatography-mass spectrometry，HILIC-MS）法制备高纯度海洋源磷脂。

1 材料与方法

1.1 试验材料

贻贝，浙江省嵊泗县华利水产有限公司；正硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）、溴化十六烷基（cetylpyridinium bromide，CPB）、钛酸四丁酯（C16H36O4Ti），上海阿拉丁试剂有限公司；硫酸（H2SO4）、磷酸（H3PO4）、高锰酸钾（KMnO4）、双氧水（H2O2）、盐酸（HCl）、乙醚（C4H10O）、石墨、尿素（CH4N2O）、氨水、环己烷（C6H12）、异丙醇（C3H8O）、丙酮（CH3COCH3）、无水乙醇（C₂H₆O）、氯仿（CHCl3，分析纯）、甲酸（CH2O2，分析纯）、甲酸铵（NH4HCO2分析纯），国药集团化学试剂有限公司（上海）；甲醇（CH4O，色谱纯）、乙腈（C2H3N色谱纯），德国Merck公司；磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC 14∶0/14∶0）（纯度≥99.9%）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE 15∶0/15∶0）（纯度≥99.9%）、磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI 16∶0/16∶0）（纯度≥99.9%），美国Avanti公司。

1.2 仪器与设备

Acquity 高效液相色谱仪，美国Waters 公司；4000 QTRAP串联四级杆质谱仪、电喷雾离子源，美国Applied Biosystems公司；BSAl24S-CW电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；ROTINA 420R离心机，德国Hettich科学仪器公司；RE-3000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；Milli-Q 超纯水仪，法国Milli-Q 公司；JB-3型定时恒温磁力搅拌器，上海雷磁新泾仪器有限公司；Fresco 21 型高速冷冻离心机，美国Thermo 公司；氮吹仪，天津恒奥科技发展有限公司；真空冷冻干燥机，美国Labconco 公司；SEM、TEM、Digital Multimode V 扫描探针显微镜（20 万倍），日本电子株式会社；电子马弗炉、鼓风干燥箱、水浴锅，上海一恒科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 KCC-1 微球制备 参照Moon 等［19］报道的微乳液法合成KCC-1 微球。将1.10 g CPB 和0.60 g 尿素置于250 mL 圆底烧瓶内，加入30 mL 超纯水后超声处理5 min，使其均匀分散。之后继续添加0.94 mL 异丙醇和30 mL 环己烷，超声混匀。在磁力搅拌的作用下，使用注射器将3 mL TEOS 滴加到上述混合物中。在室温条件下，将均匀的混合物搅拌30 min后，加热到70 ℃，冷凝回流20 h。待反应结束后，将溶液于8 000×g下离心10 min，弃上清。剩余固形物依次用丙酮、水和无水乙醇以8 000×g离心10 min，得到的微球于60 ℃条件下干燥12 h 后，置于马弗炉中在500 ℃条件下煅烧4 h，除去表面活性剂，最终得到KCC-1微球。

称取1 g煅烧好的KCC-1微球放入250 mL圆底烧瓶中，加入40 mL HCl（1 mol·L-1），超声处理2 min 后，于80 ℃条件下反应24 h。待反应结束，加入超纯水洗涤至中性，最后用无水乙醇洗涤，所得样品置于60 ℃下真空干燥12 h，备用。

1.3.2 GO制备 采用改良的Hummer方法制备GO［20］。首先，将400 mL H2SO4和H3PO4混合液（9∶1，V/V）缓慢加入到含有3 g 石墨粉和18 g KMnO4的烧杯中。冰水浴条件下搅拌至均匀后，置于40 ℃水浴条件下，快速搅拌2 h后形成浆糊状膏体。然后，用注射器滴加一定量的水并持续搅拌30 min 后，加入5 mL 30% H2O2，此时反应液颜色由深棕色变成亮黄色。最后，用1 mol·L-1HCl 除去Mn2+，并将溶液水洗至中性后，以8 000×g离心30 min，弃上清液。将合成的GO置于室温下真空干燥过夜，备用。

1.3.3 TiO2/KCC-1 微球制备 采用水蒸气内部水解法制备TiO2/KCC-1 微球［21］。量取6 mL 钛酸四丁酯溶于4 mL 无水乙醇中，振荡混匀后，将该混合液缓慢滴加至含有1 g 活化好的KCC-1 粉末的烧杯中，边滴加边搅拌。待反应液搅拌至干燥后，置于100 ℃条件下干燥6 h。然后，将上述干燥物放入水蒸气密闭环境中，在60 ℃条件下恒温反应5 h。最后，将反应后的样品在室温下干燥后放入马弗炉中于600 ℃条件下煅烧5 h，最终得到TiO2/KCC-1微球。

1.3.4 GO/KCC-1 复合物制备 参照Agnello 等［22］报道的方法制备GO/KCC-1材料。称取1 g制备的GO 粉末溶于50 mL 超纯水中，超声处理1 h 使其均匀分散。然后，将1 g 活化好的KCC-1 粉末缓慢加入到GO 水溶液中，在磁力搅拌的条件下，于120 ℃下反应2 h。待反应结束后，以8 000×g离心10 min，弃上清。最后，用50%乙醇水溶液充分洗涤固形物以除去未结合的KCC-1 微球，再次离心后置于60 ℃条件下干燥12 h，最终得到GO/KCC-1微球。

1.3.5 材料表征 TiO2/KCC-1 微球和GO/KCC-1 复合物的形态通过SEM 和TEM 进行表征，加速电压为25 kV；使用Digital Multimode V 扫描探针显微镜获得GO/KCC-1的AFM图像。

1.3.6 样品制备 将贻贝去壳后收集组织，用搅拌器制成浆状，并置于真空冷冻干燥机中脱除水分。称取一定量的贻贝粉末，按1∶40（g·mL-1）的比例将其溶于氯仿/甲醇（2∶1，V/V）溶液中，超声辅助提取20 min 后，加入超纯水以除去亲水性杂质。然后，将混合物以8 000×g离心10 min。收集下层有机相，同时用氯仿将固体残渣再次提取。最后，合并收集到的所有有机相，并在氮气流下蒸发至干燥。在进行SPE 处理前，需将粗脂质用冷丙酮（-20 ℃）洗涤。

1.3.7 SPE 柱纯化磷脂 分别将120 mg TiO2/KCC-1

微球和GO/KCC-1 复合物装填在1 mL SPE 小柱内，其底部和顶部分别装有两个聚丙烯筛片，可以很好地控制固定的吸附剂。

TiO2/KCC-1 SPE小柱：首先，用酸化的水（pH值5）活化SPE 小柱。然后，将样品（60 mg）装于SPE 小柱上，先用10%的甲醇水溶液洗涤，再用氯仿/甲醇溶液（1∶2，V/V）以1.5 mL·min-1的流速洗脱，并将该洗脱液在氮气流下干燥。

GO/KCC-1 SPE 小柱：首先，用正己烷和氯仿/异丙醇溶液（2∶1，V/V）活化SPE小柱。然后，将样品（60 mg）装于SPE 柱上，依次用氯仿/异丙醇混合液（2∶1，V/V）和含0.1%甲酸的乙醚溶液洗涤色谱柱。最后，用氯仿/甲醇（1∶2，V/V）混合液以1.5 mL·min-1的流速冲洗小柱，获得含目标化合物的馏分，并将该馏分在氮气流下干燥。

1.3.8 HILIC-MS 分析 HILIC 分析：采用HPLC 仪和三唑基键合硅胶亲水作用色谱柱实现磷脂的有效分离。流动相A 为乙腈，流动相B 由60 mmoL·L-1甲酸铵和0.1%甲酸水溶液（pH 值4.5）组成。采用梯度洗脱模式。程序如下：0～3 min，B含量保持在5%；3～18 min，B 含量升至30%；18～23 min，B 含量持续上升至50%并保持5 min 后，降至5%。流速设定为0.6 mL·min-1，进样体积为2 µL，柱温设定为30 ℃。在每次进样前，将色谱柱洗涤以调节至初始状态，并重新平衡10 min 以实现良好的重现性。

MS 分析：采用配备电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）接口的4000 QTRAP 四级杆系统进行分析。Analyst 1.6.3 软件用于仪器控制、数据收集及处理。采用负离子模式，气帘气、气源气1 和气源气2 分别设定为1.8、2.1和2.1 bar。质谱扫描范围为质荷比（m/z）600～1 000。

1.3.9 SPE 方法性能评价 为了进一步比较TiO2/KCC-1 SPE 和GO/KCC-1 SPE 这两种方法的性能，采用富集因子（enrichment factor，EF）作为评价指标。EF是指两种方法中最后洗脱液中目标物的浓度与原溶液中该目标物浓度的比值。TiO2/KCC-1 SPE 法、GO/KCC-1 SPE 法、KCC-1 SPE 法的方法参数均为贻贝粉末1 g、上样量1 mL、填料120 mg、冲洗液4 mL［氯仿/甲醇溶液（1∶2，V/V）］。

1.3.10 高纯度磷脂制备 首先，称取100 g 填料与200 mL超纯水混合，并加入浓HCl，调节溶液pH值至5左右并保持10 min，再用超纯水洗涤至中性。然后，置于105 ℃条件下脱水活化24 h。采用干法装柱，待填料界面不再下降后，用氯仿洗脱除去层析柱中的杂质并平衡2 h，待固定相自然沉降紧实，静置待用。称取一定量经冷丙酮沉降后的磷脂样品，溶解于少量氯仿中。为了防止样品中的少量不溶杂质堵塞层析柱，先用0.22 µm滤膜抽滤后再将脂质溶液沿柱壁缓慢倒入层析柱中，然后打开恒流泵注入流动相，并同时收集洗脱液。

1.4 统计分析

通过LIPID MAPS工具包和LIPID MAPS 结构数据库（LMSD）分析磷脂的结构组成。所有的试验数据均以平均值±标准偏差表示，并采用SPSS 21.0 软件对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 KCC-1微球表征

采用微乳液法制备KCC-1 微球。在制备过程中，环己烷和超纯水分别作为油相和水相形成微乳液环境，尿素提供碱性反应环境，表面活性剂CPB为结构导向剂，TEOS 作为硅源分散于CPB 周围并发生水解、聚合、缩合等一系列反应，最后通过高温煅烧除去CPB，即得到呈放射状中心径向结构的KCC-1 微球。由KCC-1 微球的SEM 图（图1-A）可知，微球表面孔隙结构明显。由KCC-1 的TEM 图（图1-B）可知，KCC-1 为中心径向孔道结构，树枝状纤维从中心向四周发散，微球直径为250～400 nm，且大小均一、分散性良好，该结果与田华君［11］的研究结果一致。

图1 KCC-1微球的SEM（A）和TEM（B）Fig.1 SEM（A）and TEM（B）of KCC-1

2.1.1 TiO2/KCC-1 微球表征 TiO2修饰KCC-1 微球前，需要对KCC-1 表面进行活化处理。本研究采用HCl活化以增加KCC-1微球表面的羟基个数。钛酸四丁酯具有极强的水解性，可与无水乙醇形成稳定的溶胶。在搅拌的条件下，该溶胶均匀包覆在KCC-1 表面并形成薄膜。在密闭环境中，水蒸气能使微球表面的钛醇盐发生水解反应，生成水合氧化钛沉淀，随着反应的进行，最终生成钛酸。最后，通过高温煅烧使TiO2成功负载于KCC-1 表面。图2 是TiO2/KCC-1 微球的SEM（图2-A）和TEM（图2-B）。通过对比图1中KCC-1的SEM 和TEM 图发现，负载了TiO2后，KCC-1 表面的孔隙结构被凸起的颗粒填满，初步证明TiO2已负载于KCC-1 微球表面。但KCC-1 微球的形貌未发生明显变化，这可能是由于TiO2仅负载于微球表面，对其内部结构几乎无影响。

图2 TiO2/KCC-1微球的SEM（A）和TEM（B）Fig.2 SEM（A）and TEM（B）of TiO2/KCC-1

2.1.2 GO/KCC-1 微球表征 活化的KCC-1 微球表面存在大量不同键合状态的羟基和不饱和氢键［23］，而GO表面含有大量的羧基、环氧基、羟基等官能团，故活化的KCC-1 极易与GO 发生反应，生成大量的C-O-Si键。随着反应的进行，C-O-Si 键继续缩合，最终形成网状结构，将KCC-1固定于GO表面。

图3-A 和B 分别为GO 和GO/KCC-1 复合物的SEM图。结果表明，GO呈光滑的片状结构，其表面的些许褶皱与大量含氧官能团的存在有关［24］。与KCC-1反应后，GO 表面覆盖了大量的球状颗粒，且片层间的空隙明显减少，更多结合位点暴露，可提升其吸附能力。该结果初步证明KCC-1已负载于GO表面。图3-C和D显示了GO和GO/KCC-1复合物的片层厚度和表面粗糙程度。GO 表面较为光滑，厚度约为0.85 nm。而GO/KCC-1 复合物表面粗糙，呈现明显的折叠状，厚度约为4.57 nm。AFM 结果进一步说明在GO 表面包覆了KCC-1微球。

图3 GO和GO/KCC-1复合物的SEM（A、B）和AFM（C、D）Fig.3 SEM（A and B）and AFM（C and D）of GO and GO/KCC-1

2.2 基于TiO2/KCC-1 和GO/KCC-1 SPE 选择性吸附磷脂

2.2.1 TiO2/KCC-1 SPE选择性吸附磷脂 基于HILICMS 方法和磷脂标品PC 14∶0/14∶0、PE 15∶0/15∶0 和PI 16∶0/16∶0 建立的外部校准模型，对样品中每种磷脂进行量化分析，结果见表1。这些模型的线性范围为0.31～200 µg·mL-1，且R2≥0.994 9，证明了这些模型的可行性。磷脂经TiO2/KCC-1 SPE 纯化后，贻贝中PC 含量（4.79 µg·mg-1）最丰富，占磷脂总量的一半以上（53.18%）。PE含量为3.83 µg·mg-1，而PI含量仅为0.21 µg·mg-1。

表1 基于HILIC/MS方法建立磷脂标品的校准曲线Table 1 Calibration curves of phospholipid standards using HILIC-MS

如表2所示，总共鉴定出35种磷脂分子，包括18种PC、10种PE和7种PI。通过MS/MS分析确定了信号较强的主要离子的脂肪酸链（sn-1/sn-2）组成，而低丰度离子则基于前期的分析经验和报道的文献进行鉴定［15］。粗脂质经冷丙酮沉降和TiO2/KCC-1 SPE 纯化后，不同种类的磷脂分子含量有了显著变化（P＜0.05）。其中，TiO2/KCC-1 SPE 纯化后m/z804.6 的含量最高，为19.45 µg·mg-1，其次是m/z850.6（18.63 µg·mg-1）和m/z824.6（12.77 µg·mg-1）。上述3个离子分别鉴定为［PC 16∶0/20∶5+HCOO］-、［PC 16∶0/22∶6+HCOO］-和［PC 16∶0/18∶1+HCOO］-。在m/z700～800中，最重要的离子是m/z716.4和m/z764.4，鉴定为［PE 16∶0/18∶1-H］-和［PE 18∶0/20∶5-H］-。通常，PC 和PE 是海洋动物中主要的磷脂类型。据报道，海洋磷脂富含不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acids，UFA），尤其是n-3 脂肪酸（EPA 和DHA），具有显著的营养优势［25］。PC 在加速脂溶性分子吸收、改善大脑记忆功能以及减缓老化过程中起着关键作用［10］。PE 可促进人体血液和粘性脂质膜的形成［15］。经结果鉴定发现，PC 和PE 的sn-2 位置几乎均由单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）或多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）组成，例如油酸（C18∶1）、亚油酸（C18∶2）、EPA和DHA 等。据报道，UFA 的生理活性功能要明显优于SFA［1］。而PI 的含量是总磷脂中最少的，其中，m/z863.6 和m/z835.6 为主要的PI，可分别表征为［PI 18∶0/18∶1-H］-和［PI 18∶0/16∶1-H］-。上述结果表明，TiO2/KCC-1 SPE法能选择性吸附磷脂以达到纯化的目的。该结果也证实了贻贝中含有大量UFA型磷脂。

表2 不同方法处理后样品中磷脂种类的结构鉴定和含量Table 2 Identity and content of phospholipid in samples processed by different methods

2.2.2 GO/KCC-1 SPE 选择性吸附磷脂 将经冷丙酮沉降后的样品进行GO/KCC-1 SPE 柱处理，结果见表2。与B&D 法和TiO2/KCC-1 SPE 法相比，样品经GO/KCC-1 SPE法处理后，PC 16∶0/20∶5（m/z804.6）的变化最为显著（P＜0.05），其次是PC 16∶0/18∶1（m/z850.6）和PC 16∶0/22∶6（m/z824.6）。该结果与上述TiO2/KCC-1 SPE法的结果相一致。在m/z700～800范围，PE 16∶0/18∶1（m/z716.4）和PE 18∶0/22∶6（m/z790.5）是含量变化较大的两个离子。根据鉴定结果可知，EPA/DHA 型PE分子占51.37%。据报道，EPA/DHA 型PE 分子具有调节肠道免疫反应、调节肠道菌群组成和缓解慢性应激功能［17］。本研究共鉴定了7 种PI 分子，其中，PI 18∶0/18∶1（m/z863.6）和PI 18∶0/16∶1（m/z835.6）是两种最丰富的PI 分子，含量分别为2.98 和2.54 µg·mg-1。B&D 法是提取脂质最常用的方法之一，为本研究磷脂纯化的起点。采用B&D 法从贻贝中提取的脂质往往含有大量的杂质，如甘油酯、游离脂肪酸等，故磷脂含量较低。根据相似相溶原理，利用预冷的丙酮充分洗涤粗脂质可将部分中性脂质除去，实现对磷脂的初步纯化［25-26］。对于SPE 法，将经冷丙酮沉降后的磷脂样品添加到GO/KCC-1柱中，并用有机溶剂洗涤该柱。在洗涤过程中，大部分杂质被除去，磷脂的纯度显著提高。该结果说明GO/KCC-1 SPE法可高效地富集磷脂。

仅从纯化前后磷脂含量的变化而言，TiO2/KCC-1 SPE 和GO/KCC-1 SPE 法均能实现纯化磷脂的目的。根据EF 结果可知，TiO2/KCC-1 SPE 法测定PC 和PE 的EF 最高，分别为2.76和2.95。而GO/KCC-1 SPE 法测得的EFPC和EFPE分别为2.61 和2.84。KCC-1 SPE 法中的EF 最低，EFPC和EFPE分别仅为0.76 和0.86，这主要是由于KCC-1 作为填料容易塌陷且吸附能力较弱。而GO/KCC-1 SPE 法的EF 值略低于TiO2/KCC-1 SPE法的原因，可能是由于GO/KCC-1 填料表面存在部分未与GO 表面含氧官能团结合的KCC-1 颗粒而降低了其吸附能力。因此，TiO2/KCC-1 SPE 法是一种更为理想的选择性吸附磷脂的方法。

2.3 方法学验证及高纯度磷脂制备

基于R2、线性范围、检测限（limit of detection，LOD）、定量限（limit of quantification，LOQ）及日间和日内精密度验证了TiO2/KCC-1 SPE HILIC-MS 方法测定贻贝中磷脂含量的可行性。LOD和LOQ分别为0.18～0.53和0.45～1.46 µg·mL-1。日内精密度的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于7.12%，日间精密度的RSD 为5.74%～7.27%。通过将磷脂标准品溶液（50、100 和150 µg·mL-1）加标到贻贝样品中分别进行回收率试验。通过计算可知，其相对回收率均高于88.25%。结果表明，TiO2/KCC-1 SPE HILIC-MS 方法具有较高的灵敏度、良好的精密度及回收率。基于上述试验结果，采用TiO2/KCC-1 SPE 法制备高纯度磷脂。经液相分析所制备磷脂的纯度高达93.57%。

3 讨论

SPE 法是纯化磷脂最常用的方法之一，但传统的吸附剂对磷脂纯化效率不高。提高磷脂纯化效率的关键在于吸附剂的选择。金属氧化物（如TiO2）具有路易斯酸-碱特性，在酸性环境中可与磷脂结合，以实现与其他物质分离的效果，而在碱性环境中则可直接达到纯化富集的目的。研究表明，金属氧化物选择性纯化磷脂具有良好的应用前景；但TiO2颗粒粒径较小，且比表面积不大，不适合直接做SPE 填料［8，15］。通常需要将TiO2负载于硅胶颗粒之上［11］。Shen 等［27］成功制备了TiO2负载SiO2核壳式（TiO2/SiO2）纳米材料并用于纯化虾加工副产物中的磷脂，其相对回收率仅为74.80%。而本研究成功制备了TiO2/KCC-1 新型介孔核壳式纳米复合填料，相较于TiO2/SiO2具有更高的纯化效率（88.25%），其主要原因是TiO2/KCC-1 填料的比表面积较TiO2/SiO2更大，这表明填料中可用于吸附磷脂的TiO2分子含量更高。

由于GO 结构中存在大量的褶皱孔穴和孔道且比表面积大，故常将其作为新型的碳纳米吸附材料。Shen 等［28］制备了GO/TiO2纳米复合材料并将其作为吸附剂富集磷脂，结果表明该复合材料具有良好的吸附磷脂的特性。为扩大GO 的应用范围，本研究通过化学合成法成功制备了GO/KCC-1，并有效地纯化了磷脂。然而，根据EF的测定结果可知，本研究建立的GO/KCC-1 SPE 法的EFPC和EFPE（2.61 和2.84）相较已报道的GO/TiO2SPE 法（2.97 和3.03）低［28］，其主要原因可能是GO/TiO2填料中路易斯酸-碱特性更强，能特异性结合更多的磷脂。由于时间和试验条件的限制，本研究直接参考现有的化学合成方法并未进行方法优化，后续可分析不同TiO2和GO 添加量对TiO2/KCC-1和GO/KCC-1复合材料作用效果的影响。

4 结论

本研究首先合成了KCC-1 微球，并对其进行功能化修饰，制备了TiO2/KCC-1 和GO/KCC-1 材料。然后将两种新型材料作为填料制成SPE 柱，对贻贝中的磷脂进行选择性吸附。根据HILIC-MS 分析结果可知，相较于GO/KCC-1 SPE 法，TiO2/KCC-1 SPE 法是一种更为理想的选择性吸附磷脂的方法。通过方法学验证，表明TiO2/KCC-1 SPE HILIC-MS 方法具有良好的精密度、较高的灵敏度及回收率。最后，采用TiO2/KCC-1 SPE法制备了高纯度磷脂（93.57%）。