余文莉 余 旋，2 刘德春 杨 莉 匡柳青 宋 杰 刘 勇，* 胡 威，*

（1江西农业大学农学院，江西 南昌 330045；2江西省农业技术推广中心，江西 南昌 330046）

2021年，我国柑橘产量为5 595.6万t［1］，产业规模位居全球第一，宽皮柑橘产量也居世界首位［2］。浮皮是宽皮类柑橘果实成熟过程中普遍发生的生理性病害［3-4］，严重影响果实品质。近年，各地采用设施延迟采收栽培技术生产完熟宽皮柑橘，经济效益提高的同时也使浮皮问题更加突出，因此亟待研究有效控制浮皮的方法。

采前控制柑橘果实浮皮的措施主要包括叶面喷施钙和植物生长调节剂，钙可显著降低温州蜜柑果实浮皮指数［5-6］。张秋明等［7］研究表明，醋酸钙、赤霉素（gibberellic acid，GA3）均能有效降低温州蜜柑果实浮皮率，以GA3效果最佳，并且果皮膜脂过氧化程度降低。Garcia-Luis 等［8］及Pozo 等［9］也证实GA3可显著降低温州蜜柑果实浮皮发生率。但单独使用钙抑制果实浮皮的效果并不理想［10-11］，而GA3会使果实转色困难［8-9］。研究表明，外源芸苔素内酯（brassinolide，BR）能促进钙吸收与转运并增加其在细胞质中的积累［12-13］，因此，BR与钙组合使用对抑制浮皮的效果值得进一步研究。此外，二氢茉莉酸丙酯（prohydrojasmon，PDJ）能显著改善梨和葡萄等果实的着色［14-15］，因此，将GA3与PDJ 联合喷施可有效降低温州蜜柑果实浮皮，同时减轻对果实着色的影响［16］，但着色难问题依然难以避免，仍需结合其他植物激素进行调节［17］。综上，钙剂、GA3与PDJ联合使用的方法仍需进一步优化。

研究认为，浮皮的发生机制与果皮衰老相关，涉及到果皮细胞形态和结构的变化，即细胞壁物质果胶、纤维素及半纤维素等的降解导致细胞间连接松散［3，18］。浮皮果中参与果皮代谢的相关酶类活性发生改变，如果胶甲酯酶（pectin methyl enzyme，PME）、纤维素酶（cellulase，Cx）等的活性显著高于正常果［19-20］；此外，浮皮果中抗氧化相关酶类活性显著下降；乙烯会加剧浮皮的产生，而抑制乙烯的合成则能降低浮皮的发生率［21-22］，同时生长素（indoleacetic acid，IAA）、细胞分裂素（cytokinin，CTK）以及GA3也影响着浮皮的发生；浮皮果中，参与以上代谢相关的基因表达量也与正常果实有显著差异［23］。然而，GA3和PDJ 处理是否影响果皮细胞壁物质的降解从而抑制果实浮皮鲜见报道。

因此，本研究以设施完熟栽培温州蜜柑宫川（CitrusunshiuMarc.）为试验材料，通过喷施不同浓度和不同次数的钙剂、GA3和PDJ，分析其在减轻浮皮现象中产生的作用，从而研究适宜的宽皮柑橘果实浮皮调控措施，同时探究 GA3和PDJ 抑制浮皮发生的生理及分子机制，以期为进一步提高温州蜜柑品质提供实践和理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料与处理

以设施完熟栽培的温州蜜柑宫川为试验材料，选取生长健壮、长势均衡的结果树为试验树。各处理设置见表1，并设置清水对照。选取果实生长状况相同且处于同一受光方向的树枝做好标记，每枝约40～50 个果实，每组设置3 个重复，用于记录成熟期果实浮皮指数的动态变化。在果实开始出现浮皮现象后，即花后天数（Days after flower，DAF）204（DAF 204）每隔15 d统计浮皮指数，并选择大小、生长状况一致且无机械损伤的果实用于后续试验。

表1 试验设计Table 1 Experimental design

1.2 试验方法

1.2.1 浮皮指数的测定 浮皮程度分为4级，浮皮无（0）、浮皮轻（1为仅果柄端浮皮）、浮皮中（2为果柄端与两侧都浮皮）、浮皮重（3为全果浮皮），通过指头触感判断每个果实的浮皮程度，最后计算果实的浮皮指数：

浮皮指数=［Σ（浮皮级果数×代表级值）/（调查总果数×最高代表值）］×100。

1.2.2 果实细胞结构观察 果实采摘后分离果皮，参考邱丽等［24］的方法制作果皮石蜡切片，最后用IX73型倒置显微镜（日本OLYMPUS 公司）观察切片后的果皮细胞结构。

1.2.3 果实品质的测定 将收集的果实样品用电子天平测定单果重，游标卡尺测定果实横纵经和果皮厚度。用TA.XT ExpressC 型质构仪（英国Stable Micro Systems 公司）测定果皮穿刺强度，取最大值为果皮硬度。用MINOLTA CR-400 型色彩色差计（日本柯尼卡美能达公司）测定果皮色差，记录L*、a*、b*值，并计算色差指数（color contribution index，CCI）=1 000a*/（L*×b*）。用PAL-1 型手持式糖度计（日本Atago 公司）测定可溶性固形物含量；用酸碱滴定法测定可滴定酸含量；用2，6-二氯靛酚氧化滴定法测定维生素C（vitamin C，Vc）含量；用蒽酮比色法测定总糖含量。

1.2.4 果胶含量的测定 参考马丽等［25］的方法进行测定。

1.2.5 纤维素含量的测定（1）将干燥的果皮样品充分研细，称取0.1 g 样品放入10 mL 刻度离心管中。用3%的十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）加满，沸水浴1 h 让其充分水解。于10 000 r·min-1离心10 min，残渣用蒸馏水和丙酮（分析纯）洗涤3 次，离心分离后去除上清液。（2）原离心管中用2 mol·L-1HCl加满，沸水浴50 min，冷却后离心10 min，收集上清液定容至100 mL，得到半纤维素溶液，用地衣酚法测定其含量。（3）残渣用丙酮洗两次，在60 ℃烘箱中烘干过夜。加入3 mL 的72% H2SO4于35 ℃水解1 h，加热完毕后将离心管用蒸馏水加满，100 ℃加热1 h。冷却后离心10 min，取上清液定容至100 mL，得到纤维素溶液，用蒽酮比色法测定其含量。

1.2.6 PME、多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、Cx 活性的测定 采用植物多聚半乳糖醛酸酶（PG）ELISA 检测试剂盒、植物果胶甲酯酶（PME）ELISA 检测试剂盒和植物纤维素酶（Cellulase）ELISA检测试剂盒（上海优选生物科技有限公司）测定果皮样品中的PME、PG、Cx 活性的变化，每组设置3 个生物学重复，所有步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.7 内源激素含量的测定 内源激素含量委托武汉迈特维尔生物科技有限公司测定。从处理树上随机选取果实采摘后擦净分离果皮，标记整理并置于-80 ℃液氮速冻待用。

1.3 基因表达分析

使用植物总RNA 快速抽提试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取果皮总RNA，用反转录试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）反转录成cDNA。

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）所用引物使用Primer 5.0 软件设计，内参基因Actin及各个基因的引物序列见表2。使用Bio-Rad CFX96-PCR 实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad公司）进行基因表达量分析，采用20 µL 反应体系：TB Green®Premix Ex Taq 10 µL，10 µmol·L-1正反向引物各0.5 µL，cDNA 模板1 µL，RNase-free H2O 8 µL。反应程序为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40 个循环。3 次生物学重复，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

1.4 数据分析

利用Excel 2019 软件进行数据整理分析以及DPS 9.01 软件进行方差分析（P＜0.05），用Origin 2019b 软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同处理对果实浮皮的影响

本研究比较了采前使用不同浓度醋酸钙、醋酸钙加BR，以及GA3加PDJ 喷施不同次数对完熟栽培温州蜜柑果实浮皮指数的影响。由表3 可知，除A8 处理外，其他处理均可抑制果实浮皮指数的增加，单独喷施0.05%和0.1%质量浓度醋酸钙（A1、A2处理）时，其浮皮指数直至花后264 d（DAF 264）仍显著低于CK，而喷施0.2%醋酸钙（A3 处理）时，其浮皮指数则在DAF 234 后与CK 无显著差异，表明醋酸钙浓度的增加并不能进一步降低果实浮皮指数。同时，0.05%醋酸钙加BR 联合喷施时（A4、A5 处理），其浮皮指数在DAF 234后与CK 无显著差异，并且BR 浓度的增加会导致浮皮指数的上升。而GA3结合PDJ 采前喷施3 次（A6 处理）的处理果实浮皮指数直至完熟栽培温州蜜柑全部采摘上市时（DAF 279）均显著低于CK，而喷施2 次（A7 处理）处理的浮皮指数在DAF 219、DAF 234、DAF 264、DAF 279 同样显著低于CK，说明采前喷施2 次或3 次3.3 mg·L-1GA3以及25 mg·L-1PDJ 均能有效降低完熟栽培温州蜜柑果实浮皮指数。

表3 不同处理在不同时期的果实浮皮指数Table 3 Fruit puffing index of different treatments in different stage

2.2 不同处理对果实品质的影响

各处理于完熟栽培果实品质最佳时期［26］（DAF 264）进行取样分析其内外在品质。由表4 可知，CK 单果质量为123.30 g，各处理单果质量均高于CK，但均无显著差异；同时，各处理果实横纵径也与CK 均无显著差异；除A8 处理外，其他各处理果皮厚度低于CK，但并无显著差异。此外，A2、A3、A6处理CCI值均显著低于CK，其他处理CCI值则与CK无显著差异。

表4 不同处理对果实外观品质的影响Table 4 Effect of different treatments on fruit appearance quality

由表5 可知，各处理果实可溶性固形物及可溶性糖含量与CK 相比均无显著差异，而A4、A7 处理则较CK显著增加了果实可滴定酸含量，其他处理果实可滴定酸含量虽与CK 无显著差异，但均在不同程度上增加了果实可滴定酸含量。另外，A7处理显著增加了果实Vc含量，其他处理则与CK差异不显著。

表5 不同处理对果实内在品质的影响Table 5 Effect of different treatments on the intrinsic quality of the fruit

2.3 GA3和PDJ处理后果皮解剖结构及形态观察

以浮皮指数最低的A6处理果实为研究对象，观察GA3和PDJ 处理后果皮解剖结构及细胞形态与CK浮皮果果皮的差异。由图1 可知，果实纵切面可明显观察到CK 果皮与果肉出现较大间隙，果肉和果皮已经分离，而GA3和PDJ 处理后的果皮和果肉间隙小，未出现明显的分离。对果皮进行石蜡切片观察，浮皮果（图2-A）的果皮细胞间隙大，细胞排列分散且无规律分布，大小不一，形状呈不规则圆形或长椭圆形，油胞直径较大、形状不一。而GA3和PDJ处理后（图2-B）的果皮组织细胞间隙小，大小相近，形状较为规则呈圆形或近椭圆形，排列较为整齐致密，油胞直径较小，边缘整齐分布薄壁组织细胞。

图1 GA3和PDJ处理后果实浮皮状态Fig.1 Puffing state of the fruit after GA3 and PDJ-treat

2.4 GA3和PDJ处理对果皮硬度及钙含量的影响

由图3-A 可知，在花后204～279 d，随着时间的延长，果皮硬度整体呈下降趋势，并且6个时期中除DAF 264时 PDJ和GA3处理后的果皮硬度显著增加外，其余时期均极显著高于CK，其硬度分别增加了42.0%、46.0%、48.3%、49.8%、42.9%和59.0%，除花后264 d，增加的幅度随时间延长而逐渐增大。同时，分别检测CK 果实出现明显浮皮前时期（FPQ，DAF 204）、出现明显浮皮后时期（FPH，DAF 264）以及GA3和PDJ 处理后与CK 同时期果皮中钙元素含量，由图3-B 可知，在FPQ 时期的CK 和GA3+PDJ 处理钙元素含量分别为42.86、31.60 mg·L-1，CK 高于GA3+PDJ 处理。而在FPH 时期钙元素含量分别为35.91、36.07 mg·L-1，CK与GA3+PDJ处理之间并无显著差异。随着取样时期的延长，CK 钙元素含量呈下降趋势，而GA3+PDJ 处理钙元素含量则较稳定。

2.5 GA3和PDJ处理对果皮果胶、纤维素含量的影响

本研究分析了GA3+PDJ 处理和CK 果皮中细胞壁物质含量的差异，由图4-A 可知，GA3和PDJ 处理在FPQ 时期的可溶性果胶含量与CK 无显著差异，而CK在FPH时期可溶性果胶含量为22.48 mg·g-1，GA3和PDJ处理为15.36 mg·g-1，极显著低于CK。GA3和PDJ 处理在FPQ时期的原果胶含量显著高于CK，在FPH时期极显著高于CK（图4-B）。两个时期半纤维素（图4-C）含量均极显著高于CK，分别比CK 高38.83%和28.79%。两个时期原果胶含量分别比CK高20.16%和41.06%。GA3和PDJ 处理在FPQ 时期纤维素（图4-D）含量极显著低于CK，在FPH时期则与CK无显著差异，但在浮皮出现前后CK 的纤维素含量下降的幅度高于GA3和PDJ 处理，CK 纤维素含量下降45%，而GA3和PDJ 处理仅下降31.7%。这表明GA3和PDJ 可能是通过抑制果皮原果胶和半纤维素的降解来阻止细胞壁的崩解从而抑制浮皮的发生。

图4 GA3和PDJ处理对果皮细胞壁物质的影响Fig.4 Effect of GA3 and PDJ-treat on peel cell wall composition

2.6 GA3 和PDJ 处理对果皮细胞壁水解酶活性的影响

本研究检测了参与果皮细胞壁降解相关水解酶类活性，结果显示在FPQ 时期，GA3和PDJ 处理与CK 的PME 活性分别为4.39 和3.26 U·g-1，在FPH 时期分别为4.67 和6.02 U·g-1，GA3和PDJ 处理在FPQ 时期显著高于CK，而在FPH 极显著低于CK，其PME 活性保持相对稳定，而CK 果皮中PME 活性在FPH 则急剧上升（图5-A）。在FPH 时期的PG 活性较FPQ 时期有上升趋势，但GA3和PDJ 处理和CK 之间并无显著差异（图5-B）。GA3和PDJ 处理果皮中Cx 活性在FPH 时期极显著低于CK，在浮皮出现前后时期虽有上升趋势但相比CK 上升幅度不大，而CK 的Cx 活性则上升2.3 倍以上（图5-C）。可见，GA3和PDJ 对PME 和Cx 活性抑制作用较强，而对PG活性作用不明显。

图5 GA3和PDJ处理对果皮细胞壁水解酶活性的影响Fig.5 Effect of GA3 and PDJ-treat on the cell wall hydrolase activity of the pericarp

2.7 GA3和PDJ处理对果皮中激素含量的影响

由图6-A 可知，在FPQ 和FPH 两个时期，GA3和PDJ 处理后的果皮IAA 含量均极显著高于CK，两者均随时间的延长呈下降趋势。GA3和PDJ 处理果皮GA3含量在FPQ 时期极显著高于CK，而在FPH 时期则极显著低于CK（图6-B）。GA3+PDJ 处理脱落酸（abscisic acid，ABA）含量在FPQ 时期与CK 无显著差异，而在FPH 时期则极显著高于CK，GA3+PDJ 处理和CK 的ABA含量分别为180.48和152.73 ng·g-1（图6-C）。果皮中玉米素核苷（trans-Zeatin-riboside，ZR）含量则与GA3表现出相同趋势，在FPQ 时期表现为GA3+PDJ 处理极显著高于CK，而到FPH 时期反而极显著低于CK（图6-D）。乙烯合成前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）含量在FPQ 和FPH 两个时期均表现为GA3+PDJ 处理极显著低于CK，其含量分别只有CK 的38%和32%左右（图6-E）。由此表明，GA3加PDJ 处理可显著抑制果皮中IAA的减少和乙烯的合成。

图6 GA3和PDJ处理对果皮激素的影响Fig.6 Effect of GA3 and PDJ-treat on pericarp hormones

2.8 GA3和PDJ处理后浮皮相关基因表达分析

GA3和PDJ 处理后果皮中生长素原初响应基因CitIAA27表达量在FPQ 时期极显著高于CK，在FPH时期显著高于CK，分别比CK 高77.04%和30.52%（图7-A）。乙烯合成关键酶基因CitACO表达量则在FPQ时期显著低于CK，较CK低21.74%；在FPH时期极显著低于CK，较CK 低88.07%（图7-B）。乙烯信号响应蛋白基因CitETR1表达量在FPQ 和FPH 时期均极显著高于CK，分别比CK高49.79%和343.92%（图7-C）。纤维素酶基因CitCx与CitACO表达结果类似，在FPQ 时期显著低于CK，在FPH 时期极显著低于CK（图7-D）。多聚半乳糖醛酸酶基因CitPG的相对表达量虽在两个时期高于CK 但并无显著差异（图7-E）。果胶酯酶基因CitPME表达量在FPQ 和FPH 时期均极显著低于CK（图7-F）。经GA3和PDJ处理后，果皮中过氧化物酶基因CitPOD12表达量也均较CK 极显著降低（图7-G），表明果皮中膜脂过氧化水平降低。

3 讨论

Sato 等［16］报道了GA3和PDJ 处理能显著抑制露天栽培温州蜜柑果实浮皮。同时，Ma 等［17］研究表明，GA3和PDJ处理虽能抑制果实浮皮但果实着色困难，需结合ABA 和萘乙酸（naphthalene-acetic acid，NAA）处理才能使果实正常着色。本研究中，在采前喷施2 或3 次GA3和PDJ 均能显著抑制完熟栽培温州蜜柑果实浮皮，延长果实挂果时间且对果实内在品质无显著影响，而喷施2 次同样对果实CCI 无显著影响，因此本研究在前人的基础上优化了GA3与PDJ 的使用方法。在南丰蜜橘幼果期喷施钙能显著抑制浮皮［27］。本试验中不同钙处理均能有效抑制完熟栽培温州蜜柑果实浮皮的发生，但综合而言喷钙抑制浮皮效果并没有GA3和PDJ处理好。此外，有研究显示BR 能促进植物对钙的吸收与运输［12-13］。然而，本试验中钙结合BR 共同喷施温州蜜柑，浮皮指数反而相对更高，Morillon 等［28］的研究认为BR 能增强细胞壁松弛度，同时诱导一些细胞壁修饰酶的表达，使细胞壁发生降解，由此推测BR 的这一特性虽能促进钙的吸收但反而使果实浮皮更严重。同时，也说明钙并不是决定果实浮皮的唯一因素，GA3加PDJ处理后钙元素在浮皮果和正常果果皮中含量并无显著差异也证实了上述推测。综上所述，采前喷施2次GA3加PDJ抑制柑橘果实浮皮效果最佳。

Shiraishi 等［18］通过透射电镜观察果皮细胞壁超微结构，结果显示浮皮果细胞间隙变大，细胞壁出现部分溶解，纤维含量减少，细胞间连接松散。本研究中GA3与PDJ 处理后的果皮石蜡切片显示，细胞结构相比于CK 排列更加规则紧密，果皮油胞体积小，说明该处理能够抑制果皮细胞结构的崩解，与前人研究结果相似［18］。前人研究发现，外施GA3后，浮皮果果皮中原果胶含量降低，细胞壁PG 和Cx 活性升高，细胞膜脂过氧化作用增强，果实衰老加快，有效降低了PE 活性和浮皮率［19，29］。Huai等［30］研究发现，叶面喷钙也能抑制细胞壁物质的降解，提高果皮硬度从而降低柑橘皱皮果发生率。本研究中，GA3与PDJ 处理极显著增加了果皮中原果胶和半纤维素含量，并且纤维素含量下降的幅度也低于CK，相应的细胞壁水解酶类（PME、Cx）活性及控制相关酶合成的基因表达量也极显著低于CK，与前人研究结果类似［30］，即GA3与PDJ 处理延缓了细胞壁结构的崩解，从而抑制果实浮皮的发生。此外，研究显示，通过抑制果皮膜脂过氧化程度加重，降低果皮中POD 活性，能使南丰蜜橘果实浮皮空间率显著降低［27］，说明膜脂过氧化化程度也与果实浮皮密切相关。本研究同样发现，GA3与PDJ 处理后果皮中CitPOD12基因表达量极显著低于CK，表明果皮细胞膜脂过氧化程度降低，从而抑制了果实浮皮指数的增加。

乙烯可加剧柑橘果实浮皮，而抑制乙烯的生物合成则能降低浮皮的产生［21-22］。植物对乙烯敏感性的高低可通过乙烯受体基因表达水平的调控来实现，按照负调控模型的观点，受体表达水平越高，植物响应乙烯的敏感性越差［31］。拟南芥［Arabidopsisthaliana（L.）Heynh.］受NaCl胁迫时，乙烯受体蛋白ETR1的减少导致了拟南芥对乙烯敏感性增强，反之ETR1 蛋白的增加会导致植物对乙烯敏感性减弱［32］。与之相似，在本研究中，GA3与PDJ 处理在FPQ 和FPH 时期均极显著降低了乙烯合成前体ACC 含量，并且乙烯合成基因CitACO表达量也显著（FPQ）和极显著（FPH）低于CK，CitETR1基因表达量均极显著高于CK，说明GA3与PDJ处理抑制果实乙烯的合成，同时使果实对乙烯的敏感性降低，进而抑制果实浮皮的发生。生长素对柑橘果实后熟衰老有抑制作用，在果实完熟过程中IAA 含量会持续下降。果实枯水通常也被认为是浮皮中的一种，枯水果实果皮中IAA含量显著低于正常果，枯水果实果皮衰老程度高于正常果［33］。本研究同样发现，经GA3与PDJ处理后，果皮中IAA 含量极显著高于CK，同时果皮中生长素原初反应基因CitIAA27表达水平极显著（FPQ）和显著（FPH）高于CK。在Aux/IAA 家族基因中，部分成员在生长素处理早期被诱导表达，生长素消耗后逐渐恢复［34］，园艺作物黄瓜中的CsIAA27基因也受生长素诱导表达［35］。显然，本研究中GA3与PDJ 处理完熟栽培的温州蜜柑，可以延缓果皮中IAA 含量下降，而较高浓度的生长素诱导了果皮中CitIAA27基因的表达，进而延缓了果皮衰老从而抑制浮皮的发生。

4 结论

本研究优化了GA3与PDJ 在抑制完熟栽培温州蜜柑果实浮皮中的使用方法，即在DAF 155 和DAF 185分别喷施3.3 mg·kg-1GA3与25 mg·kg-1PDJ 可显著抑制果实浮皮的发生，同时对果实着色未产生不利影响。明确了GA3与PDJ 抑制柑橘果实浮皮发生的生理及分子机制，即通过降低果皮中乙烯合成以及阻止IAA 的降解从而延缓果皮衰老，下调CitCx和CitPME等基因的表达降低PME和Cx活性，从而抑制果皮中细胞壁物质原果胶、纤维素及半纤维素的降解，防止果皮细胞壁的崩解，同时降低果皮细胞膜脂过氧化程度，从而抑制浮皮发生。