甘平，蓝军

作者单位：武警重庆总队医院呼吸与危重症医学科，重庆400061

重症肺炎是临床常见的呼吸系统危重症之一，除引发呼吸衰竭外，还可引发神经、心血管系统功能障碍，具有病情进展急骤、救治难度大、病死率高等特点。全身炎症反应激活是重症肺炎重要的病理生理特征，持续激活的炎症反应会造成全身多个脏器功能损害、严重者发展为多器官功能障碍综合征并造成死亡［1］。因此，深入认识炎症反应的调控机制是目前研究重症肺炎发病机制、评估及防治手段的重要靶点。微RNA（miR）是具有广泛生物学活性的小分子RNA，参与包括炎症反应在内多种病理生理过程的调控，也能释放进入外周血并作为评估病情的标志物［2-3］。沉默信息调节因子1（Sirt1）是去乙酰化酶sirtuin家族的一员，可提高细胞对凋亡及炎症反应的抗性，其高表达与机体炎症反应的减轻关系密切［4］。一项动物实验表明，重症肺炎大鼠肺组织中miR-34a的表达显著增加、Sirt1 的表达显著降低，抑制miR-34a 通过上调Sirt1的表达减轻重症肺炎大鼠的肺损害［5］。但miR-34a 及其靶向调控的Sirt1 在重症肺炎病人体内的变化、相关性及其对病人预后是否存在评估价值尚不清楚。因此，本研究对重症肺炎病人miR-34a、Sirt1表达水平及其在重症肺炎预后评估中的应用价值，旨在为临床重症肺炎的诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2017 年10 月至2020 年4 月武警重庆总队医院收治的64 例重症肺炎病人作为研究的重症肺炎组，同期收治的80例普通肺炎病人作为普通肺炎组，纳入标准：（1）参照《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016 年版）》［6］中疾病的诊断标准，符合重症肺炎或普通肺炎的诊断；（2）病人性别不限，年龄≥18 岁；（3）入组前未接受免疫抑制剂或激素治疗。排除标准：（1）合并肺结核、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等其他呼吸系统疾病；（2）合并恶性肿瘤、结缔组织病；（3）存在严重肝肾功能障碍病人。另取同期进行健康体检的70 例健康志愿者作为对照组。一般资料比较见表1。本研究病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

表1 重症肺炎64例、普通肺炎80例与健康志愿者70例一般资料的比较

1.2 研究方法

1.2.1 肺炎病情严重程度评估 参照《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南（2016年版）》［6］采用肺炎严重指数（PSI）进行肺炎病情的评估，Ⅰ级和Ⅱ级为低危病人、Ⅲ级和Ⅳ级为中危病人、Ⅴ级为高危病人。

1.2.2 外周血miR-34a表达水平检测 采用实时荧光定量聚合酶链（qRT-PCR）法检测miR-34a 的表达水平。①总RNA提取：取重症肺炎组、普通肺炎组病人入院后次日晨起空腹静脉血5 mL，对照组体检当日空腹静脉血5 mL，2 500 r∕min离心5 min，分离血清后，低温保藏待测；应用miRNeasy Mini Kit 试剂盒（德国QIAGEN 公司）提取血清总RNA，紫外分光光度计（美国贝克曼库尔特有限公司，DU800 型）测定RNA 浓度及纯度。②cDNA 反转录：总RNA 经凝胶电泳分离、纯化，采用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，-20 ℃保存备用。③qRT-PCR 检测：以cDNA 为模板，应用miRcute miRNA 荧光定量检测试剂盒（天根生化科技有限公司）检测miR-34a表达水平，引物序列为：正向5"-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT-3"，反向3"-GCCATTCAGGCTAGCAGC-5"；反应体系（20 μL）包括：2×miRcute miRNA Premix 10 μL、上下游引物各0.4 μL（10 μmol∕L），6.8 μL DEPCtreated water。循环参数：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 10 s、63 ℃ 31 s（40 cycles）。以U6 为内参，miRNA 表达结果采用2-ΔΔCt计算，每个样本检测3 次，取平均值。以中位值2-ΔΔCt=1.45 为截断值，2-ΔΔCt≥1.45 为miR-34a高表达，2-ΔΔCt＜1.45为miR-34a为低表达。

1.2.3 血清Sirt1 水平检测 取病人血清样本，使用全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，迈瑞BS280）采用酶联免疫吸附法检测血清Sirt1水平。相关试剂盒由上海酶联公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。以中位值Sirt1表达水平=7.15 μg∕L为截断值，Sirt1表达水平≥7.15 μg∕L为Sirt1高表达，Sirt1表达水平＜7.15 μg∕L为Sirt1低表达。

1.2.4 血清炎性细胞因子水平检测 取病人血清样本，采用酶联免疫吸附法检测血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、白细胞介素（IL）-6 和高迁移率族蛋白B-1（HMGB1）水平。相关试剂盒由上海酶联公司提供，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.5 预后评估 采用电话或门诊复查的方式对病人进行随访，随访时间为入院后30 d，记录病人30 d累积生存率。生存时间定义为入院当日至随访截止时或病人死亡时；因肺炎以外原因死亡的为截尾数据。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计量资料（均服从正态分布）以±s表示，两组间比较行独立样本t检验；三组间及不同病情严重程度病人各指标比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t比较；采用Pearson 检验分析重症肺炎组miR-34a表达水平与血清Sirt1含量的相关性；采用Kaplan-Meier 生存分析研究miR-34a 与Sirt1 表达水平与重症肺炎组病人预后的关系，Log rank 检验比较组间差异；影响重症肺炎病人预后的因素采用Cox回归分析。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 重症肺炎组、普通肺炎组、对照组miR-34a、Sirt1表达水平的比较重症肺炎组、普通肺炎组病人miR-34a 表达水平高于对照组，Sirt1 表达水平低于对照组（P＜0.05）；重症肺炎组病人miR-34a 的表达水平高于普通肺炎组，Sirt1 表达水平低于普通肺炎组（P＜0.05）。见表2。

表2 重症肺炎64例、普通肺炎80例与健康志愿者70例外周血miR-34a表达水平、血清Sirt1含量的比较∕ ± s

表2 重症肺炎64例、普通肺炎80例与健康志愿者70例外周血miR-34a表达水平、血清Sirt1含量的比较∕ ± s

注：miR-34a为微RNA-34a，Sirt1为沉默信息调节因子1。①与对照组比较，P＜0.05。②与普通肺炎组比较，P＜0.05。

组别对照组普通肺炎组重症肺炎组F值P值Sirt1∕（μg∕L）12.11±1.77 8.94±1.62①6.83±1.59①②26.58＜0.001例数70 80 64 miR-34a 1.00±0.25 1.32±0.33①1.65±0.28①②19.39＜0.001

2.2 重症肺炎组miR-34a 表达水平与血清Sirt1 含量的相关性重症肺炎组病人miR-34a 表达水平与Sirt1表达水平存在明显负相关（r=-0.31，P＜0.001）。

2.3 重症肺炎组中不同病情严重程度病人miR-34a、Sirt1 表达水平的比较高危病人、中危病人miR-34a 表达水平高于低危病人，Sirt1 表达水平低于低危病人（P＜0.05），高危病人miR-34a 表达水平高于中危病人，Sirt1 表达水平低于中危病人（P＜0.05）。见表3。

表3 重症肺炎64例不同病情严重程度病人miR-34a、Sirt1表达水平的比较∕ ± s

表3 重症肺炎64例不同病情严重程度病人miR-34a、Sirt1表达水平的比较∕ ± s

注：miR-34a为微RNA-34a，Sirt1为沉默信息调节因子1。①与低危病人比较，P＜0.05。②与中危病人比较，P＜0.05。

组别低危中危高危F值P值Sirt1∕（μg∕L）7.85±1.70 6.78±1.60①5.49±1.41①②9.63＜0.001例数21 28 15 miR-34a 1.41±0.25 1.63±0.27①2.03±0.32①②22.20＜0.001

2.4 重症肺炎组中不同外周血miR-34a表达水平病人血清炎性细胞因子的比较重症肺炎组中miR-34a高表达病人的血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、HMGB1 含量高于miR-34a低表达病人（P＜0.05）。见表4。

表4 重症肺炎64例外周血miR-34a不同表达水平病人血清炎性细胞因子的比较∕ ± s

表4 重症肺炎64例外周血miR-34a不同表达水平病人血清炎性细胞因子的比较∕ ± s

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，ICAM-1为细胞间黏附分子-1，IL-6为白细胞介素-6，HMGB1为高迁移率族蛋白B-1。

HMGB1∕（ng∕L）109.39±22.51 83.52±16.59 5.40＜0.001类别高表达低表达t值P值例数32 32 TNF-α∕（μg∕L）13.22±3.22 10.71±2.94 3.37 0.001 ICAM-1∕（μg∕L）513.25±73.59 409.39±66.47 6.10＜0.001 IL-6∕（ng∕L）212.56±36.59 169.51±31.29 5.21＜0.001

2.5 重症肺炎组中不同血清Sirt1 含量病人血清炎症细胞因子含量的比较重症肺炎组中Sirt1 高含量病人的血清TNF-α、ICAM-1、IL-6、HMGB1 含量低于miR-34a低含量病人（P＜0.05）。见表5。

表5 重症肺炎64例血清Sirt1含量不同病人血清炎症细胞因子的比较∕ ± s

表5 重症肺炎64例血清Sirt1含量不同病人血清炎症细胞因子的比较∕ ± s

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，ICAM-1为细胞间黏附分子-1，IL-6为白细胞介素-6，HMGB1为高迁移率族蛋白B-1。

HMGB1 81.52±17.11 111.39±21.99 6.06＜0.001组别高含量低含量t值P值例数32 32 TNF-α 10.92±2.77 13.02±3.39 2.71 0.009 ICAM-1 412.54±68.12 510.10±71.94 5.57＜0.001 IL-6 171.44±31.91 210.63±35.97 4.61＜0.001

2.6 重症肺炎组中不同外周血miR-34a 表达水平及血清Sirt1 含量病人预后的比较重症肺炎组中miR-34a 高表达病人的30 d 累积生存率22 例（68.75%）低于miR-34a 低表达病人29 例（90.63%），差异有统计学意义（χ2=4.73，P=0.030）。Sirt1 高含量病人的30 d 累积生存率30 例（93.75%）高于Sirt1低含量病人21例（65.63%），差异有统计学意义（χ2=7.82，P=0.005）。

2.7 影响重症肺炎病人预后的Cox回归分析多因素分析结果显示，ICAM-1、miR-34a及Sirt1均是影响重症肺炎病人预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表6。

表6 重症肺炎64例预后的影响因素Cox回归分析

3 讨论

重症肺炎的病情危重且进展迅速，早期准确评估病情有助于及时进行危险分层及个体化防治，对改善预后、降低死亡率具有重要意义［7-9］。目前，重症肺炎的发病机制尚不十分清楚，寻找炎症反应关键的上游调控机制不仅有助于认识重症肺炎的发病机制，也有助于发现重症肺炎新的防治靶点及病情评估的标志物。

miR 能够在转录后水平调节基因的表达，进而实现对多种生物学过程的调控，以miR 为切入点进行研究，不仅能够为认识疾病的发病机制提供依据，还能为疾病的评估提供新的标志物［10-11］。已有研究证实，在重症肺炎的发病过程中，病人外周血中存在多种miRs 表达的变化，提示miRs 可能是用于重症肺炎病情评估的潜在分子［12-13］。吴舒懋等［5］的动物实验提示miR-34a 的高表达参与重症肺炎的发生及病情的加重。

本研究以外周血miR-34a 表达的变化为切入点，对重症肺炎发病及病情的评估进行分析。在重症肺炎及普通肺炎病人的外周血中miR-34a 均呈高表达，且重症肺炎病人外周血miR-34a 的表达水平高于普通肺炎，提示在肺炎的发病过程中存在miR-34a 的表达增加且随着病情从普通肺炎进展到重症肺炎、miR-34a 的表达水平进一步增加。在重症肺炎病人中进一步按照PSI 评估病情，随着病情从低危发展至高危，病人外周血中miR-34a 的表达水平也呈增加趋势，以上结果表明在重症肺炎发生及病情加重的过程中存在miR-34a 的高表达，与重症肺炎动物实验中miR-34a表达变化的结果吻合。

既往研究表明，miR-34a 造成肺损伤的机制与靶向抑制Sirt1有关，其在干细胞衰老、T细胞免疫调节和非酒精性脂肪肝的发生过程中也对Sirt1 的表达具有靶向抑制作用［14-16］。Sirt1 是一种去乙酰化酶，在多种组织脏器损害的过程中通过抑制炎症反应的激活起到保护作用［17］。本研究结果表明Sirt1含量降低与重症肺炎的发生及病情加重有关。进一步进行相关性分析可知：重症肺炎病人外周血miR-34a 的表达水平及血清中Sirt1 的含量具有负相关，提示在重症肺炎发病的过程中miR-34a 可能靶向Sirt1发挥生物学作用。

在重症肺炎的发病过程中，炎症反应的级联放大激活是重要的病理生理特征，涉及TNF-α、ICAM-1、IL-6、HMGB1等多种炎症细胞因子的大量释放［18-19］。本研究对不同miR-34a表达水平及Sirt1含量的重症肺炎病人体内炎症细胞因子进行了分析，结果表明miR-34a 表达增加及Sirt1 含量降低与重症肺炎发病过程中多种炎症细胞因子释放增加有关。

重症肺炎发病后炎症反应的持续激活是造成预后不佳、病死率高的重要原因［7，20］。本研究对入组的64例重症肺炎病人的预后进行了评估，入院后30 d死亡15例、累计死亡率23.44%。经分析可知：随着miR-34a表达增加、Sirt1含量降低，重症肺炎病人的30 d累积死亡率呈升高趋势，表明miR-34a表达增加及Sirt1含量降低不仅与重症肺炎病人的病情加重、炎症反应激活有关，还与病人的预后有关，miR-34a及Sirt1的变化会造成30 d的累积死亡率增加。此外，危险因素分析显示，ICAM-1、miR-34a及Sirt1均是影响重症肺炎病人预后的独立危险因素，进一步提示miR-34a 及Sirt1的变化与重症肺炎病人30 d的预后有一定关系，二者均可作为反映预后的有效指标。

综上所述，重症肺炎病人外周血中miR-34a 表达增加与血清中Sirt1含量降低具有相关性，且miR-34a、Sirt1 的变化与病情加重、炎症反应激活、预后恶化有关。今后，miR-34a 靶向Sirt1 有望成为研究重症肺炎发病机制、防治及评估手段的新靶点。