童偲辰

作者单位：北京市和平里医院普外科，北京100000

肛周脓肿是一种因细菌感染导致的急性或慢性化脓感染性疾病，其临床表现为肛周疼痛和高热［1］。目前治疗的主要方式为手术切除脓肿及引流［2-3］。由于脓肿位置的特殊性，使创面反复感染的风险增加，从而加剧病人疼痛，延缓康复时间［4］。因此，找到一种有效的治疗方式，加快手术创口的愈合，对于疾病的治疗具有重要意义。p38∕丝裂原活化蛋白激酶2（MK2）信号通路是与炎症性疾病密切相关的传导通路，p38∕MK2 信号通路的激活可引起机体炎症反应加剧，相关炎性因子的水平升高［5］。有研究显示，当p38∕MK2 信号通路相关蛋白过表达时，可引起机体创面的愈合速度降低，不利于创面修复［6］。因此，本研究致力于找到一种药物来抑制p38∕MK2 信号通路蛋白的表达，从而加速肛周脓肿术后的愈合。近年来中医成为了各种疾病治疗方式的研究热点。基于对伤口涂抹沙棘提取物有利于加速创面的愈合［7-8］及其增强免疫力等作用为基础，于2021 年6—12 月进行本研究，观察其对肛周脓肿术后创面愈合的作用，并探讨其作用机制，以期为临床肛周脓肿术后的相关治疗提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 6周龄SPF级SD大鼠，购自重庆陆军军医大学，体质量范围200～220 g，动物生产许可号SCXK（渝）2019-0009；动物使用许可号SYXK（渝）2019-0069；动物合格证号20191254，所有大鼠均饲养于SPF级动物房，动物房内室温：20～25 ℃，湿度40%～60%，动物房光照昼夜交替（12 h∕12 h），动物自由饮水饮食。本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.1.2 试剂 沙棘提取物（南京建成生物工程研究所，纯度99.99%）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β 和IL-6 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（上海优宁维生物有限公司）；RT-qPCR 试剂盒（上海优宁维生物有限公司）；蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所）；p38、MK2、β-肌动蛋白（β-actin）蛋白抗体（美国，abcam公司）。

1.1.3 仪器 BX53 显微镜（日本奥林巴斯公司）；全自动酶标仪（美国伯乐公司）；电泳仪（美国Thermo 公司）；伯乐Mini-PRO 荧光定量PCR 仪（美国伯乐公司）；LAS 4000 成像系统（美国GE Healthcare 公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组、建模和干预 选取SD 大鼠60 只，采用随机数字表法将大鼠随机分成假手术组、模型组、阳性对照组（左氧氟沙星，63 mg∕kg）、沙棘提取物低（5 g∕kg）、中（10 g∕kg）、高（20 g∕kg）剂量组，每组10 只。配置1%戊巴比妥钠溶液，以1 mL∕kg 剂量腹腔注射麻醉大鼠，大鼠背部备皮并消毒皮肤，手术刀作直径2 cm圆形切口，在切口处滴加1 mL粪便上清液（粪便上清液制作方法：在5 mL 生理盐水中加入10 g人新鲜粪便，混匀后半径10 cm、3 000 r∕min 离心15 min，取上清液备用），用纱布覆盖创口，并上颈环避免大鼠舔舐伤口，假手术组除不滴加粪便上清液其余步骤相同。48 h 后创面发现脓性分泌物，并伴有粪臭味，提示建模成功。建模成功后手术清除大鼠脓肿并进行清洗，然后纱布覆盖48 h后进行后续实验［9-10］。48 h后沙棘提取物各剂量组和阳性对照组灌胃相应的药物，模型组和假手术组灌胃相同体积的生理盐水，持续14 d。

1.2.2 检测指标和方法

1.2.2.1 大鼠创面形态学观察 大鼠建模成功后，选择两名不参与本次实验，但具有动物实验经验的实验室人员对各组大鼠0 d和观察期（7 d和14 d）的创面大小进行测量，并根据公式计算大鼠创面的愈合率。愈合率=（0 d创面面积-观察期创面面积）∕建模成功时的创面面积×100%。

1.2.2.2 大鼠创面组织病理结构观察 实验末期，采用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后大鼠固定在解剖板上取大鼠创面组织，并用0.9%生理盐水清洗组织表面血渍，然后放于福尔马林溶液中固定48 h，最后制作HE 染色切片并在显微镜下观察组织毛细血管和成纤维细胞变化情况。

1.2.2.3 大鼠 血 清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平检测 实验末期，采用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，采用非抗凝管取大鼠全血3 mL，4 ℃，2 500 r∕min 离心15 min，取上清液于一支新的离心管中，置于-80 ℃保存，备用。采用ELISA 法检测血清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 的水平，根据ELISA 试剂盒说明书，对血清样本进行处理后，采用全自动酶标仪在450 nm 波长处检测样本吸光度，并根据标准曲线来计算样品中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度。

1.2.2.4 总RNA 提取及RT-qPCR 法检测p38、MK2 mRNA表达水平 根据RNA提取试剂盒提取60只大鼠创面组织中总RNA，并利用反转录试剂盒得到cDNA 保存至-80 ℃备用。RT-qPCR 体系：SYBR Green qPCR SuperMix 16.25 μL，特异性引物2.0 μL，模板cDNA3.25 μL，加入DEPC 水，使反应体系为30 μL。扩增条件：94 ℃，12 min；94 ℃，15 s；62 ℃，40 s；72 ℃，30 s；共40个循环。设置3个复孔，以GAPDH为内参，根据公式（2-ΔΔCt法）计算、分析p38、MK2mRNA 表达。引物序列：p38 正向5"-GCTACGTGCGTAGCTAGTA-3"，反向5"-CGGCATGCTACGATGC-3"；MK2 正向5"-TTCGATGTAGTAATTACGCG-3"，反 向5"-GCATTGCGTGTAGCA-3"；GADPH 正向5"-AGCGATTTAGCTAGC-3"，反向5"-CCCGAGTCAGTAAAT-3"。

1.2.2.5 大鼠p38、MK2蛋白水平检测 处死大鼠步骤同上，取1 g大鼠创面组织放入玻璃研磨器中，加入1 mL RIPA 溶液充分研磨，3 000 r∕min离心10 min后取上清液，检测蛋白浓度，调节蛋白浓度使其为3 mg∕L，每孔上样量为10 μL后进行电泳，将凝胶上的蛋白转移至硝化纤维素膜，5%脱脂奶粉溶液对硝化纤维素膜封闭2 h后，将特异性抗体p38、MK2和β-actin一抗1∶5 000稀释，4 ℃条件下一抗摇晃孵育12 h，孵育后的硝化纤维素膜使用1%吐温20清洗3次，每次5 min，清洗后二抗（1∶1 000）孵育2 h，孵育后清洗步骤同上，最后使用显影剂后在凝胶成像系统上显影。

1.3 统计学方法本实验数据采用SPSS 23.0 进行统计分析，正态定量数据用±s描述，多组比较采用单因素方差分析，多重比较为SNK-q检验；重复测量数据（创伤愈合率）比较使用重复测量方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 沙棘提取物对大鼠创面愈合率的影响与假手术组比较，模型组大鼠创面愈合率显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和沙棘提取物各剂量组大鼠创面愈合率显著升高，且沙棘提取物各剂量组大鼠创面愈合率呈剂量依赖性（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠创面愈合率比较∕（%， ± s）

表1 各组大鼠创面愈合率比较∕（%， ± s）

注：①与假手术组比，P＜0.001。②与模型组比，P＜0.001。③与阳性对照组比，P＜0.001。④与沙棘提取物低剂量组比，P＜0.001。⑤与沙棘提取物中剂量组比，P＜0.001。

创面处理后14 d 72.68±3.79 52.72±3.15①92.61±4.62②60.33±3.29②③71.18±5.66②③④89.75±5.11②④⑤10.22＜0.001组别假手术组模型组阳性对照组沙棘提取物低剂量组沙棘提取物中剂量组沙棘提取物高剂量组F值P值鼠数10 10 10 10 10 10创面处理后7 d 49.86±3.64 14.96±1.30①72.39±4.99②40.25±3.70②③50.26±4.10②③④69.75±4.16②④⑤24.04＜0.001

2.2 大鼠创面组织学变化大鼠创面组织病理结果显示，模型组大鼠创面组织生长状态不佳，表皮厚度最薄，细胞边界模糊，细胞排列紊乱；阳性对照组和沙棘提取物各剂量组表皮厚度明显增加，且随着沙棘提取物剂量的增加表皮厚度逐渐增厚；假手术组恢复情况与沙棘提取物中剂量组类似，见图1。

图1 各组大鼠肛周脓肿术后创面组织病理变化情况（HE染色×200）

2.3 沙棘提取物对大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和沙棘提取物各剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6显著降低，且沙棘提取物各剂量组效应呈剂量依赖性（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比较∕（ng∕L， ± s）

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比较∕（ng∕L， ± s）

注：TNF-α为肿瘤坏死因子，IL为白细胞介素。①与假手术组比，P＜0.001。②与模型组比，P＜0.001。③与阳性对照组比，P＜0.001。④与沙棘提取物低剂量组比，P＜0.001。⑤与沙棘提取物中剂量组比，P＜0.001。

IL-6 82.63±5.28 136.54±10.75①62.60±6.57②109.22±9.79②③85.38±8.07②③④64.78±6.23②④⑤30.12＜0.001组别假手术组模型组鼠数10 10阳性对照组10沙棘提取物低剂量组10沙棘提取物中剂量组10沙棘提取物高剂量组F值P值10 TNF-α 31.59±4.15 104.88±10.37①20.16±1.19②58.74±4.87②③30.92±3.05②③④21.35±3.11②④⑤39.06＜0.001 IL-1β 0.62±0.05 2.02±0.13①0.42±0.03②1.13±0.07②③0.65±0.05②③④0.47±0.05②④⑤18.22＜0.001

2.4 沙棘提取物对大鼠创面p38、MK2mRNA 表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠创面p38、MK2 mRNA 显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和沙棘提取物各剂量组大鼠创面p38、MK2 mRNA 显著降低，且沙棘提取物各剂量组效应呈剂量依赖性（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠p38、MK2 mRNA表达水平比较∕ ± s

表3 各组大鼠p38、MK2 mRNA表达水平比较∕ ± s

注：MK2为丝裂原活化蛋白激酶2。①与假手术组比，P＜0.001。②与模型组比，P＜0.001。③与阳性对照组比，P＜0.001。④与沙棘提取物低剂量组比，P＜0.001。⑤与沙棘提取物中剂量组比，P＜0.001。

MK2 mRNA表达1.00±0.03 1.70±0.14①0.61±0.08②1.30±0.11②③0.98±0.06②③④0.66±0.07②④⑤20.18＜0.001组别假手术组模型组阳性对照组沙棘提取物低剂量组沙棘提取物中剂量组沙棘提取物高剂量组F值P值鼠数10 10 10 10 10 10 p38 mRNA表达1.00±0.02 1.82±0.12①0.69±0.07②1.35±0.10②③0.96±0.09②③④0.75±0.09②④⑤29.96＜0.001

2.5 沙棘提取物对大鼠创面p38、MK2蛋白表达的影响与假手术组比较，模型组大鼠创面p38、MK2蛋白表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组和沙棘提取物各剂量组大鼠创面p38、MK2 蛋白表达显著降低，且沙棘提取物各剂量组效应呈剂量依赖性（P＜0.05），见表4，图2。

图2 各组大鼠p38、MK2蛋白表达情况

表4 各组大鼠创面p38、MK2蛋白表达水平比较∕ ± s

表4 各组大鼠创面p38、MK2蛋白表达水平比较∕ ± s

注：MK2为丝裂原活化蛋白激酶2。①与假手术组比，P＜0.001。②与模型组比，P＜0.001。③与阳性对照组比，P＜0.001。④与沙棘提取物低剂量组比，P＜0.001。⑤与沙棘提取物中剂量组比，P＜0.001。

MK2蛋白表达0.63±0.07 0.92±0.10①0.33±0.04②0.80±0.09②③0.59±0.07②③④0.36±0.06②④⑤13.14＜0.001组别假手术组模型组阳性对照组沙棘提取物低剂量组沙棘提取物中剂量组沙棘提取物高剂量组F值P值鼠数10 10 10 10 10 10 p38蛋白表达0.61±0.07 0.89±0.08①0.29±0.03②0.75±0.09②③0.56±0.08②③④0.32±0.04②④⑤10.09＜0.001

3 讨论

肛周脓肿是一种由大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌等感染引起的肛门直肠科疾病［11］。手术治疗是目前临床上最常用的治疗方式，大多数病人在术后即可痊愈，但由于肛周特殊的解剖结构和发病部位，术后伤口极易引发感染，减缓创面愈合［12］。创面组织毛细血管的生成和成纤维细胞产生是影响创面愈合的重要因素之一，同时机体内血清相关炎性因子的水平有效地反应了机体炎症反应的情况，对于创面的愈合也具有一定的影响［13］。因此，有效抑制机体炎症反应、促进创面组织毛细血管和成纤维细胞的生成对于肛周脓肿术后创面的愈合有重要影响。沙棘是一种广泛存在于我国各地区的落叶小灌木，其果实和籽油已被多项研究证实具有较高的药用价值［14］。在本研究中，我们模拟了肛周脓肿术后大鼠模型，同时采用沙棘提取物对其进行治疗，通过对比各组大鼠创面部位的愈合情况，发现当对大鼠进行沙棘提取物治疗后，可有效提高大鼠的创面愈合速度，且随着沙棘提取物治疗剂量的增加，大鼠创面的愈合率显著增加。提示沙棘提取物可有效加速肛周脓肿术后大鼠创面的愈合，这可能与沙棘提取物的抗炎功效有关。

创面的愈合主要分为炎症反应、组织修复与组织改建三个时期［15］。炎症反应是创面愈合早期的主要影响因素，因此本研究检测了各组大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6。TNF-α 是体内一种重要的促炎细胞因子，在多种生理反应中起着至关重要的作用，如炎症介质的合成和释放、中性粒细胞在肺部的积聚和补体激活［16］。IL-6 是活化T 细胞和成纤维细胞产生的关键细胞因子，可催化和放大炎症反应，其表达水平可有效反映组织细胞损伤的严重程度，可作为急慢性炎症临床诊断的有效指标［17］。IL-1β 是一种重要的炎性因子，可诱导产生和释放多种炎性因子［18］。本研究结果显示，当大鼠发生肛周脓肿，其血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 均显著升高，在给予沙棘提取物治疗后，血清TNF-α、IL-1β和IL-6 均显著降低，同时结合各组大鼠病理结果，发现沙棘提取物各剂量组表皮细胞恢复良好，厚度增加，表明沙棘提取物可通过降低机体血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平，减缓炎症反应，同时促进毛细血管和成纤维细胞生成，从而达到加速创面愈合的功效。

既往有研究表明，p38∕MK2 信号通路在机体创面组织的修复过程中起到重要作用，当机体创伤发生时，p38∕MK2信号通路被激活，同时刺激机体血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达增加，导致炎症反应加剧［19］。本研究在进行沙棘提取物治疗后，结果显示p38、MK2 mRNA 和蛋白表达水平降低，提示沙棘提取物的治疗抑制了p38∕MK2 信号通路，进而降低了机体炎症反应，对肛周脓肿大鼠术后创面的愈合起到了促进作用。

综上所述，本研究表明沙棘提取物可有效加速肛周脓肿大鼠术后创面的愈合，其机制可能是通过抑制机体p38∕MK2 信号通路，以及降低血清促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达，从而逆转机体的炎症反应，达到加速愈合的效果。

（本文图1见插图1-1）