高岩

作者单位：盘锦检验检测中心，辽宁 盘锦124010

牛膝主要药用部位为干燥根，分布于河北、河南、山西等地区，产于河南的（怀牛膝）药用价值上乘，具有补肝肾、强筋骨、活血通络等功效［1-2］。现代药理研究表明，牛膝含有植物甾酮、多糖、皂苷等多种成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、镇痛等多种功效［3-4］。合理的采收期不仅能保证药材产量、时间成本，还能稳定药材质量［5］。关于怀牛膝采收时期中不同生长年限与采收期对中药牛膝化学成分影响的文献研究报道较少，而采收时期中生长年限的不统一可影响道地药材的临床使用和资源开发。因此，本研究以河南省武陟县牛膝种植基地作为依托，测定生长年限2、3、4、5、6年以及采集月份9、10、11、12 月中旬的怀牛膝样品中β-蜕皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齐墩果酸的含量，以期获得怀牛膝适宜采收期，为怀牛膝的栽培及生产提供参考。

1 仪器与材料

高效液相色谱仪、DAD 检测器购自于Waters 公司；万分之一天平（北京斯多利斯科学仪器有限公司，型号BSA124S-CW）；Milli-QAcademicA10超纯水机（美国Millipore）；25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮购自于四川成都思克生物；齐墩果酸购、β-蜕皮甾酮购自于成都艾博克生物科技有限公司。乙腈、甲醇来源于德国默克公司；正丁醇、三氯甲烷、磷酸来源于北京化工厂有限责任公司。

研究时间为2015 年4 月至2021 年12 月，牛膝样品来源于河南省武陟县牛膝种植基地，生长年限2、3、4、5、6年，采集月份分别为9、10、11、12月，均为每月中旬；每个采收日期收集3 个样品，共60 份样品，所有样品经河南中医药大学药学院鉴定为苋科植物牛膝干燥根。

2 方法

2.1 有机化学成分含量测定有机化学成分包括β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齐墩果酸。

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称定齐墩果酸4.25 mg，β-蜕皮甾酮4.64 mg，25R-牛膝甾酮3.85 mg，25S-牛膝甾酮4.88 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，轻轻摇匀至完全溶解，对照品溶液对应浓度为0.425、0.464、0.385、0.488 g∕L。

甾酮类混合对照品溶液配制：分别精密量取2 mL β-蜕皮甾酮（0.464 g∕L）、25R-牛膝甾酮（0.385 g∕L）、25S-牛膝甾酮（0.488 g∕L）对照品溶液，置于10 mL容量瓶中，混匀即可。

2.1.2 供试品溶液的制备 甾酮类供试品溶液的制备：取牛膝粉末（过三号筛）2 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，加入50 mL水饱和正丁醇，浸泡过夜。超声处理30 min，冷却，补足重量，过滤。精密量取25 mL 滤液，蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至5 mL即可。

齐墩果酸供试品溶液的制备：取牛膝粉末（过三号筛）1 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶中，加入25 mL盐酸溶液（2 mol∕L），浸泡过夜。100 ℃水浴回流提取3 h，冷却，补足重量，过滤，滤渣用蒸馏水冲洗3 次，将滤渣放入60 ℃烘箱内烘干，转移至锥形瓶中。精密加入25 mL 三氯甲烷，加热回流提30 min（提取两次），滤过，合并滤液，蒸干，甲醇溶解残渣并定容至25 mL即可。

2.1.3 色谱条件 色谱柱：Waters XB Ridge C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量10 μL。齐墩果酸：流动相：乙腈-水-冰乙酸（90∶10∶0.1）；流速：1mL∕min；检测波长为205 nm。甾酮：流动相：乙腈-水-甲酸（15∶85∶0.1）；流速：1 mL∕min；检测波长为250 nm。对照品、混合对照品及样品溶液见图1。

图1 HPLC图谱：齐墩果酸对照品（A）、齐墩果酸样品（B）、甾酮类对照品（C）、甾酮类样品（D）

2.1.4 方法学考察 以对照品质量浓度为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），采用线性回归绘制标准曲线，回归方程及相关系数（r）见表1，4 种成分的线性关系良好，相关系数r值＞0.999。精密吸取“2.1.2”项下的供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6 次，β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齐墩果酸峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为0.25%、0.22%、0.26%、0.20%，表明本试验仪器精密度良好。按“2.1.3”项平行制备6 份供试品溶液，按“2.1.3”项条件进行测样，β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齐墩果酸的平均质量分数RSD 分别为2.04%、2.12%、2.42%、1.84%，表明该方法重复性良好。精密吸取“2.1.2”项下的供试品溶液，放置2、4、8、12 h，进样分析，β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齐墩果酸峰面积RSD 分别为2.14%、1.88%、2.26%、1.68%，表明供试品溶液在制备后12 h 内稳定性良好。取同一批次已知含量的粉末约0.5 g，平行6份，分别加入定量对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下条件进行测验，计算β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齐墩果酸的平均回收率在98%～104%范围内，RSD 均低于2.00%，表明加样回收率良好，见表2。

表1 4种成分的线性方程及范围

表2 牛膝药材中4种成分加样回收率结果（n=6）

2.2 统计学方法所有数据采用SPSS 22.0 统计软件进行分析，计量资料的采用±s表示，多组间的比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验，采用重复测量设计方差分析进行不同时间点的组间比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 样品测定同一生长年限中，4种化学成分（β-蜕皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齐墩果酸）在不同月份采收的含量存在差异，其中10、11月含量相对较高，而9、12 月含量相对偏低。同一采收月份中，齐墩果酸、β-蜕皮甾酮生长4 年的含量高于其他年份（P＜0.05）；25S-牛膝甾酮生长3 年的含量高于其他年份（P＜0.05），而25R-牛膝甾酮生长5 年含量高于其他年份（P＜0.05）。结果见表3。

表3 不同生长年限、采收时间牛膝样品中β-蜕皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齐墩果酸的含量（n=3）∕（‰， ± s）

表3 不同生长年限、采收时间牛膝样品中β-蜕皮甾酮、25R∕S-牛膝甾酮、齐墩果酸的含量（n=3）∕（‰， ± s）

生长年限2年2年2年2年3年3年3年3年4年4年4年4年5年5年5年5年6年6年6年6年采收时间9月10月11月12月9月10月11月12月9月10月11月12月9月10月11月12月9月10月11月12月β-蜕皮甾酮齐墩果酸1.133±0.158 1.235±0.135 1.224±0.148 1.065±0.163 1.235±0.127 1.327±0.208 1.384±0.194 1.225±0.206 1.431±0.162 1.524±0.205 1.571±0.174 1.375±0.215 1.302±0.185 1.446±0.197 1.454±0.202 1.232±0.174 1.337±0.298 1.322±0.278 1.393±0.195 1.227±0.168 25R-牛膝甾酮0.234±0.018 0.225±0.022 0.235±0.026 0.218±0.019 0.215±0.024 0.234±0.024 0.241±0.016 0.220±0.021 0.221±0.024 0.235±0.018 0.242±0.029 0.226±0.019 0.236±0.023 0.249±0.022 0.243±0.025 0.228±0.018 0.214±0.025 0.245±0.022 0.236±0.023 0.222±0.025 25S-牛膝甾酮0.344±0.038 0.352±0.043 0.359±0.035 0.338±0.039 0.346±0.033 0.364±0.038 0.351±0.030 0.342±0.031 0.351±0.038 0.356±0.033 0.342±0.034 0.346±0.031 0.346±0.034 0.359±0.045 0.343±0.035 0.338±0.028 0.334±0.036 0.345±0.033 0.346±0.035 0.342±0.031 17.32±1.70 16.58±1.88 16.47±1.87 14.23±1.54 17.93±1.88 17.35±2.01 16.94±2.09 16.56±1.82 18.33±2.13 20.25±2.29 19.97±2.36 16.23±2.06 18.03±1.95 19.32±2.16 18.54±2.18 15.36±1.85 15.33±2.00 16.25±1.97 14.97±2.09 13.23±1.84

3.2 主成分分析采用SPSS 20.0 对牛膝样品中的4 个有机化学成分进行主成分分析，综合评价函数为F=0.472F1+0.254F2+0.142F3+0.088F4，其中F 值越大则综合品质越好，F1～F4为各因子得分，总得分排序见表4。牛膝在生长年限为4 年，并于11 月份采收的样品F 值最高，其次为生长年限为4 年，10 月份采收，生长年限为3 年、5 年，10、11 月份采收的质量接近。

表4 不同生长年限、采收期的牛膝主成分因子及综合分析得分

4 讨论

不同类型的中药材均有特定采收时期，如根茎类多在初春、秋冬季节采收，花类一般在含苞待放时期采收，而叶类、全草类则在生长旺盛时期采收［6-7］。2015年版《中国药典》规定，如全草类的鱼腥草可全年采收，茎木类的大血藤为秋、冬季采收，花类的金银花为夏初花开放前采收。尽管药典已对各类中药材的采收季节作出规定，但生长年限、采收月份尚未作出明确要求，而生长年限、采收月份均可能影响植物药材中活性成分含量，从而影响药材药用价值，因此此次研究通过探索生长年限、采收月份对于怀牛膝活性成分的影响，以期为优化其的采收时期提供理论依据。

怀牛膝是我国知名的传统中药材，具有祛风湿、活血消癓、补益肝肾、通经、止痛等功效［8］。《本草纲目》中记载“滋补之功，如牛之力”，临床常用于治疗寒湿、腰膝酸软、屈膝障碍、跌打损伤、经血不调等症状［9-10］。怀牛膝为多年生草本植物，安全性高，药用价值明确，药用部位为干燥根，秋冬季或初春时采收较好，该时期植株地下根含有的活性成分种类、含量最为丰富［11］。蜕皮甾酮是牛膝甾酮中最重要的药效成分，其中2020年版《中国药典》已明确规定β-蜕皮甾酮是评估牛膝质量的重要指标性成分［12］。甾酮类还包括25R∕S-牛膝甾酮、杯苋甾酮、5-表杯苋甾酮等10 余种，现代药理实验研究表明甾酮类可促进血液微循环，以及诱导成骨样细胞增殖等药理活性，与怀牛膝中医作用（强筋骨、补肝肾）相吻合［13］。既往报道认为［14］，牛膝在10 月底至11月中旬时的蜕皮甾酮含量相对最高，随着生长时间的推移，蜕皮甾酮含量呈逐渐降低趋势，直至12 月底降至较低水平。本研究还发现，生长年限为2～6年中，β-蜕皮甾酮均在不同月份采收的含量存在明显差异，其中10、11 月含量相对较高，而9、12 月含量相对偏低。另外，本次研究也发现，25R∕S-牛膝甾酮、齐墩果酸含量与β-蜕皮甾酮具有一致的变化趋势，即11 月左右采收时含相对最高。有研究［15-17］也证实，不同采收期牛膝4 种有机成分和无机元素（铅、砷、镉、汞、铜等17种元素）均呈现动态变化，11月中旬采收的牛膝药材质量最佳，结合本次研究结果进一步证实10 月底至11 月中旬为牛膝最佳采收期。

不同生长年限的怀牛膝药用价值存在差异，有研究以川牛膝根部葛根素、杯苋甾酮含量为评价指标，结果显示3年生入药为佳，为川牛膝的采收给予一定指导，但研究中活性成分指标较少，而川牛膝的实际为1～6年，且其中杯苋甾酮含量与生长年限的之间的关系并不明确，存在一定的局限性［18-19］。本研究以2～6年生怀牛膝为对象，结果发现生长期从2 年开始，有机成分含量逐年增加，于4 年达到最高点，随后逐步降低。同时，采用SPSS 20.0 对4 个有机化学成分进行主成分分析，结果显示牛膝生长年限为4 年并于11 月份采收时，综合得分最高，其次为生长年限为4 年生10 月中旬采收，生长年限为3、5年，10、11月中旬采收的质量接近。本研究通过综合分析怀牛膝中主要药效成分含量变化情况，从而确定了牛膝的最佳采收期，为确定牛膝药材生长年限、采收时间提供了理论依据，但仅通过药用活性成分含量变化情况评价怀牛膝质量，接下来将结合药效学实验进一步研究怀牛膝的适宜采收期。

综上所述，以β-蜕皮甾酮、25R-牛膝甾酮、25S-牛膝甾酮、齐墩果酸为怀牛膝药材质量的考核指标，建议4年生11月中旬为牛膝的最佳采收期。