卢忠友，顿晓琴，胡莉，张光燕，吴小微

作者单位：武汉科技大学附属汉阳医院消化内科，湖北 武汉430000

肝硬化是指由于肝脏长期损伤使肝脏组织无法正常运作而导致的肝组织瘢痕形成，也被称为肝病的终末期，最终发展为肝癌等。既往研究显示，肝硬化的诱因可能包括环境、遗传因素及两者相互作用导致的病变［1］。目前，无有效改善肝硬化的治疗方法，除了减缓肝硬化进展，只有控制症状和并发症，严重影响病人生活质量［2］。肝纤维化是形成肝硬化的必要阶段，同时在这个过程中肝星状细胞起着关键作用［3］。人微RNA（microRNA，miRNA）具有调节肝星状细胞中纤维化信号通路的能力［4］。既往研究显示，miR-144、miR-16、miR-30、miR-483 等多种miRNA 通过调节肝星状细胞，最终抑制肝纤维化进程［5］。无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员10a（Wnt10a）是Wnt 家族的重要一员。Wnt 信号通路是细胞生长和增殖的重要调节因子，能够启动对肝脏器官的正常发育所必需的信号级联反应，其活性的改变与肝癌等其他疾病的发展有关［6］。研究显示，Wnt信号通路受阻时，肝星状细胞的激活也受到抑制，继而阻止肝纤维化［7］。Wang 等［8］发现，miR-454、Wnt10a 在肝硬化小鼠及转化生长因子（TGF）-β1处理的HSC-T6细胞中异常表达，miR-454通过抑制Wnt10a来负调节肝星状细胞，从而抑制肝硬化进展。基于此，本研究旨在进一步明确肝硬化病人血清中miR-454 和Wnt10a 的表达变化，并分析其临床意义，以期为临床早期诊断提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料将武汉科技大学附属汉阳医院2018 年2 月至2020 年12 月收治的96 例肝硬化病人纳入肝硬化组，其中男、女分别为55、41 例，年龄（45.26±10.74）岁，符合肝硬化诊断标准［9］，并结合MRI、CT 影像学检查、临床表现确诊。将肝硬化组96 例 病人 进行Child-Pugh 分 级［10］：A 级36 例（≤6分）、B 级31 例（7～9 分）、C 级（≥10 分）29 例；根据肝硬化病因分为：64 例为病毒性肝炎病人，16 例为酒精性肝炎，10 例为胆汁性肝硬化，6 例为其他病因。另选同期60例在本院健康体检者，男、女分别34、26例，年龄（46.65±11.28）岁，其与肝硬化组一般资料差异无统计学意义（P＞0.05）。所有病人无肝脏手术病历史，均自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他肝脏疾病；（2）存在免疫系统疾病；（3）神经疾病病人；（4）合并其他器官衰竭。本研究经武汉科技大学附属汉阳医院伦理委员会批准（批号201712-05）。

1.2 指标检测方法

1.2.1 荧光定量PCR 检测血清miR-454 和Wnt10a表达水平 所有病人均抽取空腹外周血，分别使用RNA 提取试剂盒（百奥莱博，货号WE0197）提取血清中RNA，在微量蛋白核酸分析仪上检测RNA 质量，取1 μg RNA使用反转录试剂盒（上海东洋纺，货号FSQ-301）进行反转录，然后使用SYBR qPCR Mix（上海东洋纺，货号QPX-201T）配制反应体系，并在Q2000A 荧光定量PCR 系统（杭州，朗基）上进行反应。miR-454 和Wnt10a 分 别 以U6、GAPDH 为 内参，采用2-ΔΔCt法计算miR-454 和Wnt10a 表达水平。引物均送至上海英潍捷基生物公司合成。引物序列：miR-454 正向CCTATCAATATTGTCTCTG，反向GAACATGTCTGCGTATCTC；U6 正 向 GCTTCGGCAGCACATATACTAA， 反 向 AACGCTTCACGAATTTGCGT；Wnt10a 正 向 TGCACCGCTTACAACTGGAT，反 向TTCTCGCGTGGATGTCTCTG；GAPDH 正 向GGGAGCCAAAAGGGTCATCA，反 向TGATGGCATGGACTGTGGTC。

1.2.2 生化指标的检测 肝硬化组及对照组病人均采集空腹外周血于真空肝素抗凝管中，使用BK-1200全自动生化分析仪（博科，山东）检测总胆红素（TBil）、白蛋白（ALB）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、球蛋白（GLO）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、丙氨酸转氨酶（ALT）肝功能指标，所用试剂盒均购自上海科华生物工程股份有限公司。

1.3 统计学方法数据分析使用SPSS 25.0 软件。计数资料以例表示，采用χ2检验；计量资料符合正态分布的用±s表示，两组间比较行独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD 法。Pearson法分析miR-454、Wnt10a 与肝功能指标（GGT、CLO、AST、ALP、ALT、TBil）的相关性；Spearman 法分析miR-454、Wnt10a 与Child-Pugh 分级相关性。血清miR-454 和Wnt10a 对肝硬化严重程度的诊断效能采用受试者操作特征（ROC）曲线分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-454 和Wnt10a 表达水平比较肝硬化组血清miR-454 表达水平低于对照组，Wnt10a 表 达 水 平 明 显 高 于 对 照 组（P＜0.05）。见表1。

表1 肝硬化组与对照组miR-454、Wnt10a表达比较∕ ± s

表1 肝硬化组与对照组miR-454、Wnt10a表达比较∕ ± s

注：miR-454 为微RNA-454，Wnt10a 为无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员10a。

Wnt10a 0.94±0.23 1.67±0.31-15.73＜0.001组别对照组肝硬化组t值P值例数60 96 miR-454 1.46±0.29 0.85±0.20 15.54＜0.001

2.2 两组肝功能指标比较肝硬化组ALB 水平显著低于对照组，GGT、CLO、AST、ALP、ALT、TBil水平明显高于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 肝硬化组与对照组肝功能指标比较∕ ± s

表2 肝硬化组与对照组肝功能指标比较∕ ± s

注：miR-454 为微RNA-454，Wnt10a 为无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员10a，TBil 为总胆红素，ALB 为白蛋白，GLO 为球蛋白，GGT为γ-谷氨酰转肽酶，ALT为丙氨酸转氨酶，AST为天冬氨酸转氨酶，ALP为碱性磷酸酶。

ALP∕（U∕L）73.65±19.46 158.74±41.27-14.95＜0.001组别对照组肝硬化组t值P值例数96 96 TBil∕（mg∕dL）8.20±2.43 14.67±3.18-13.48＜0.001 ALB∕（g∕L）40.65±5.89 26.54±4.13 17.57＜0.001 GLO∕（g∕L）26.73±4.57 38.41±6.72-11.85＜0.001 GGT∕（U∕L）19.36±4.35 145.79±44.06-22.13＜0.001 ALT∕（U∕L）18.72±3.62 43.65±12.54-15.00＜0.001 AST∕（U∕L）15.84±4.24 76.42±20.39-22.68＜0.001

2.3 不同Child-Pugh 分级的病人血清miR-454 和Wnt10a 表达水平比较肝硬化C 级的病人血清miR-454 表达水平低于B 级和A 级，B 级miR-454 表达水平又低于A 级（P＜0.05）；血清Wnt10a 在肝硬化A 级、B 级 及C 级 中 的 表 达 水 平 逐 渐 增 加（P＜0.05）。表3。

表3 不同Child-Pugh分级的肝硬化96例血清miR-454和Wnt10a表达水平比较∕ ± s

表3 不同Child-Pugh分级的肝硬化96例血清miR-454和Wnt10a表达水平比较∕ ± s

注：miR-454 为微RNA-454，Wnt10a 为无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员10a。①与A级相比，P＜0.05。②与B级相比，P＜0.05。

Wnt10a 1.50±0.29 1.66±0.32①1.89±0.32①②分级A级B级C级例数36 31 29 miR-454 0.98±0.23 0.83±0.2①0.71±0.16①②12.81＜0.001 F值P值14.67＜0.001

2.4 不同病因病人血清miR-454和Wnt10a表达水平比较肝硬化组不同病因病人血清miR-454 和Wnt10a 表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表4 不同病因肝硬化96例血清miR-454和Wnt10a表达水平比较∕ ± s

表4 不同病因肝硬化96例血清miR-454和Wnt10a表达水平比较∕ ± s

注：miR-454 为微RNA-454，Wnt10a 为无翅型小鼠乳腺肿瘤病毒整合位点家族成员10a。

Wnt10a 1.69±0.32 1.64±0.30 1.61±0.27 1.64±0.30 0.28 0.840病因病毒性肝炎酒精性肝炎胆汁性肝硬化其他病因F值P值例数64 16 10 6 miR-454 0.85±0.19 0.83±0.23 0.86±0.21 0.89±0.21 0.14 0.935

2.5 血清miR-454与Wnt10a的相关性分析肝硬化组病人血清miR-454 与Wnt10a 表达水平呈负相关（r=-0.53，P＜0.001）。

2.6 血清miR-454、Wnt10a表达水平与Child-Pugh分级评分、肝功能指标的相关性血清miR-454表达水平与ALB呈正相关，与TBil、GLO、GGT、Child-Pugh分级、ALT、AST、ALP 呈负相关；血清Wnt10a 表达水平与ALB 呈负相关，与TBil、GLO、GGT、Child-Pugh分级、ALT、AST、ALP呈正相关。见表5。

表5 肝硬化96例血清miR-454、Wnt10a表达水平与Child-Pugh分级评分、肝功能指标的相关性

2.7 血清miR-454、Wnt10a 诊断严重肝硬化的ROC 曲线miR-454 诊断严重性肝硬化的曲线下面积为0.80［95%CI：（0.71，0.88）］，截断值、灵敏度、特异度分别为0.79、75.90%、74.60%；Wnt10a 诊断严重型肝硬化的曲线下面积为0.73［95%CI：（0.62，0.84）］，截断值为1.71，灵敏度为75.90%，特异度为67.20%；miR-454、Wnt10a联合诊断的曲线下面积为0.84［95%CI：（0.75，0.93）］，灵敏度为79.30%，特异度为82.10%。

3 讨论

肝硬化是一种慢性进行性肝病，常见症状为乏力、腹水、肝区疼痛及肝掌等［11］。然而肝硬化的早期发病较为隐匿，晚期会导致肝癌、急性肾损伤等，一旦发病可累及人体多个脏器，临床上无法根治，严重威胁人类健康［12］。目前，病理活检、影像学检查及血清学检查被用于临床检查肝病变，其中病理分析被视为最可靠的标准，但该方法存在着如肝病变不均匀、盲穿刺错误等不足；影像学检查费用较高、早期筛查的不确定性，尤其是在医疗条件有限的农村地区难以实现；近年来瞬态弹性成像表现出较好的应用前景，但还要进一步验证［13］。血清学是一种无创诊断方法，样本采集方便并且可以动态观察，因此筛选特异性较高的检测指标尤为重要。肝硬化形成的必要病理阶段是肝纤维化，而肝星状细胞是肝纤维化的主要标志物之一［14］。既往研究显示miRNA 及Wnt 信号通路通过调节肝星状细胞，参与肝纤维化进程［8］。因此，本研究通过检测肝硬化病人血清中miR-454 及Wnt10a 的表达水平，分析其临床意义，以期为肝硬化的血清学诊断提供依据。

先前有关肝脏中miRNA 的研究明确了许多miRNA 在人类肝脏疾病（包含肝硬化）中显著上调或下调表达，说明miRNA 是肝病中肝功能的关键调节因子［5，8，15-17］。已鉴定出miR-146、miR-181、miR-195、miR-542等多种miRNA 能够通过调节纤维相关信号通路Wnt等激活肝星状细胞促进纤维化，同时也有一部分抗纤维化的miRNA，例如miR-144、miR-16、miR-30、miR-483、miR-454 等，它们通过负向调节肝星状细胞活动，最终抑制肝纤维化进程［5］。近期有学者发现，miR-146a 基因rs2910164 位点多态性与HBV 感染者肝硬化的发生有关，并且对肝硬化程度有一定诊断价值［15］。Vuppalanchi等［16］的研究结果显示，包括miR-454 在内的六种miRNA（miR-155、miR-582-5p、miR-181d、miR-500 及let-7f-1）在肝硬化的肝脏中异常表达，并且与肝硬化程度密切相关。早在2014 年，Zhu 等［17］通过qRT-PCR 检测结果发现miR-454 在纤维化细胞中下调表达，其通过靶向Smad4 抑制肝星状细胞的活化，提示miR-454 为治疗肝纤维化提供新的方法。Wang 等［8］以肝硬化大鼠及转化生长因子（TGF）-β1处理的HSC-T6细胞为研究对象，结果显示miR-454 下调表达，Wnt10a 上调表达，miR-454 通过负调控Wnt10a 来抑制肝星状细胞的活化和增殖。结合本研究肝硬化组miR-454的低 表 达，并且在Child-Pugh A 级、B 级 及C 级中miR-454表达水平逐步降低，说明miR-454可能参与肝硬化病理过程。此外，血清miR-454 表达水平与ALB 呈正相关，与TBil、GLO、GGT、Child-Pugh 分级、ALT、AST、ALP 呈负相关，提示miR-454 表达水平与肝功能指标相关性较好。以上研究提示miR-454参与肝硬化形成过程，并与肝硬化进程呈负相关，有望成为诊断肝硬化的血清学指标。

Wnt 信号通路与肝脏细胞的发育、增殖及癌变密切相关，并且该通路的激活有助于肝星状细胞的激活并与肝星状细胞的增殖、分解及纤维化过程呈正相关［18］。研究显示，Wnt 信号通路有两种途径参与调节肝纤维化，一种是非经典Wnt信号通路（比如Wnt5a、Wnt7a），其可以诱导静息状态下的肝星状细胞激活，并转化为集成纤维细胞后进一步促进纤维化；另一种是经典Wnt信号通路（比如Wnt1、Wnt8），其通过激活肝星状细胞来诱导和促进发生纤维化［7］。Li等［19］发现，Notum 通过下调Wnt5a介导的非经典Wnt 信号通路，抑制乙型肝炎病毒诱导的肝纤维化。Wnt10a 是Wnt 家族中的一员。研究发现，Wnt10a 通过TGF-β 信号传导促进肺纤维化［20］。结合本研究Wnt10a 在肝硬化组中表达水平显著高于对照组，说明Wnt10a可能与肝硬化有关。进一步分析发现，Wnt10a 在Child-Pugh C 级表达水平明显高于B 级，B 级中Wnt10a 表达水平又高于A 级，提示Wnt10a参与肝硬化病理过程，并可能与严重程度有关。进一步分析Wnt10a与肝功能指标的相关性，结果显示血清Wnt10a 表达水平与ALB 呈负相关，与TBil、GLO、Child-Pugh 分级、GGT、ALT、AST、ALP 呈正相关，说明血清Wnt10a表达水平能够部分反映肝功能损伤程度，能够为诊断肝硬化的发生提供依据。

为了明确miR-454 和Wnt10a 表达水平是否与肝硬化致病原因有关，本研究进一步分析了肝硬化组不同病因病人血清miR-454 和Wnt10a 表达水平变化，结果显示miR-454 和Wnt10a 表达水平与病因无关。另外，本研究肝硬化组病人血清miR-454 与Wnt10a表达水平呈负相关（r=-0.53，P＜0.001），这与Wang 等［8］的研究结果一致。ROC 曲线结果显示，miR-454、Wnt10a 联合对预测严重肝硬化进展有重要意义。

综上所述，肝硬化病人血清miR-454 表达水平降低、Wnt10a 表达水平增加，miR-454 与Wnt10a 呈负相关，均与肝硬化程度存在相关性，并且miR-454与Wnt10a联合诊断严重肝硬化有较高价值。