陈诗琪，黄恬，蒲泠伶，王雪颖，叶峻

（成都师范学院 化学与生命科学学院，四川 成都 611130）

赶黄草为虎耳草科扯根菜属多年生草本植物，其所含黄酮类生物活性成分，可通过清除自由基，提高体内活性酶水平，降低受肝损模型动物血清中转氨酶水平等，具有治疗黄疸、胆囊炎、肝损伤和传染性肝炎等药效作用[1-2]，并具有减肥、神经保护、抗癌等生物功能[3-5]。同时，超声波具有强烈的振动、空化效应和搅拌作用，有利于提高提取效率，且方法简单、提取物纯度高，并可避免高温对提取成分的影响[6-8]。本研究采用超声辅助提取法优化赶黄草花、叶、杆中黄酮类物质的提取工艺，并比较赶黄草的花、叶、杆黄酮类物质的含量及其对DPPH·和OH·自由基的清除率，为探究赶黄草的药效作用及综合开发提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

紫外分光光度计（TU-1901，普析通用仪器公司），超声仪（KQ-250DE，昆山超声仪器公司）。

赶黄草花、叶、杆样品（均从淘宝网购自四川古蔺产。其中：花、叶各3 种，杆2 种），芦丁（标准品，成都康邦生物科技有限公司；乙醇、AlNO3·9H2O、KOH、NaNO2（均为AR，成都科龙试剂有限责任公司）。

1.2 样品预处理

将样品置于80 ℃干燥箱中，烘4 h 后，粉碎，过80 目（180μm）筛，装袋，密封备用。

1.3 样品中总黄酮的测定

按NaNO2-Al(NO3)3-KOH 络合物法，以芦丁为标准品，将样品提取液于512.3 nm 处测定吸光值。则：

式中：N—稀释倍数；

C—总黄酮质量浓度，mg·mL-1；

V—样品液体积，mL；

m—样品质量，g。

1.4 样品总黄酮提取物的抗氧化性测定

1.4.1 DPPH·自由基清除能力测定

参考田文翰[9]的实验方法，将样品总黄酮提取液稀释至1.00 mg·mL-1，并各取2.0 mL 于20 mL 试管中，分别加入2.0 mL 0.2 mmol·L-1DPPH，混合均匀，置于暗处30 min 后，用95%乙醇做空白实验，于517 nm 处测吸光度。则DPPH 自由基清除率为：

式中：Ai—样品吸光度；

Ax—95%乙醇代替DPPH 测得吸光度；

Ao—空白吸光度。

1.4.2 OH·自由基清除能力测定

参考高亚妮[10]的实验方法，将样品总黄酮提取液稀释至0.40 mg·mL-1，并各取1.0 mL 于20 mL 试管中，分别依次加入1.0 mL 9 mmol·mL-1FeSO4、1.0 mL 9 mmol·L-1水杨酸-乙醇溶液和1.0 mL 8.8 mmol·L-1H2O2，用蒸馏水稀释至10.0 mL，摇匀，置于37 ℃水浴锅中，30 min 后于510 nm 处测定吸光度（Ai）；用蒸馏水代替H2O2，其余步骤不变，测定吸光度（Ax）；用蒸馏水做空白对照实验，测定吸光度（Ao）。OH·清除率SR 计算同“1.4.1”。

2 结果分析

2.1 总黄酮提取工艺优化

2.1.1 料液比的影响

分别取预处理后的花、叶、杆样品1.000 0 g，各4 份。参考孙宗良[1]用65% 乙醇为提取剂，固定：超声温度：45 ℃，超声功率：100 W，超声时间：45 min；设置料液比（g∶mL）1∶15，1∶20，1∶30，1∶40，提取样品中的总黄酮，结果见图1。

图1 料液比对总黄酮得率的影响

由图1 可见：以65% 乙醇为提取剂，花、叶、杆样品分别在料液比为1∶20、1∶30、1∶30 时，总黄酮得率最大，分别为：9.4%、8.0%、3.2%。因此，花、叶、杆样品总黄酮提取的最佳料液比(g∶mL)分别为：1∶20、1∶30、1∶30。

2.1.2 提取时间的影响

分别取预处理后的花、叶、杆样品1.000 0 g，各4 份。固定超声提取功率：100 W，超声温度：45 ℃，提取剂：65% 乙醇，料液比(g∶mL)：1∶30（其中：花样品设为1∶20）。设置提取时间（min）：20、30、45、60，提取样品中总黄酮，结果见图2。

图2 提取时间对总黄酮得率的影响

由图2 可见：在超声功率：100 W，超声温度：45 ℃时，花、叶、杆样品分别在超声提取30、45、45 min 时，总黄酮得率最大，分别为：10.4%、8.0%、3.2%。因此，花、叶、杆样品总黄酮提取的最佳时间依次为：30、45、45 min。

2.1.3 提取温度的影响

分别取预处理后的花、叶、杆样品1.000 0 g，各4 份。固定超声提取功率：100 W，提取剂：65%乙醇，料液比(g∶mL)：1∶30（其中：花样品设为1∶20），提取时间：45 min（其中：花样品设为30 min）。设置提取温度（℃）：20、35、45、55，提取样品中总黄酮，结果见图3。

图3 超声温度对总黄酮得率的影响

由图3 可见：在超声功率：100 W，提取时间：45 min（其中：样品“花”为30 min）时，花、叶、杆样品均在35 ℃时提取，总黄酮得率最大，分别为：11.2%、8.1%、3.4%。因此，花、叶、杆样品总黄酮提取的最佳温度均为：35 ℃。

2.1.4 超声功率的影响

分别取预处理后的花、叶、杆样品1.000 0 g，各4 份。提取温度：35 ℃，提取剂：65% 乙醇，料液比(g∶mL)：1∶30（其中：样品“花”设为1∶20），提取时间：45 min（其中：样品“花”设为30 min）。设置超声提取功率（W）：70、80、90、100、110，提取样品中总黄酮，结果见图4。

图4 超声功率对总黄酮得率的影响

由图4 可见：在超声功率：100 W，提取温度：35 ℃，提取时间：45 min（其中：样品“花”为30 min）时，花、叶、杆样品在提取功率依次为100、80、90 W 时，总黄酮得率最大，分别为：11.2%、9.2%、4.0%。因此，花、叶、杆样品总黄酮提取的最佳功率依次为100、80、90 W。

2.1.5 总黄酮提取工艺条件

综合2.1.1-2.1.4，用65%乙醇为提取剂，超声辅助法提取赶黄草花、叶、杆样品中总黄酮的最佳工艺条件，见表1。

表1 样品中总黄酮提取工艺条件

2.2 样品测定与回收实验

按表2 中各样品超声辅助提取最佳工艺条件，分别对赶黄草花、叶、杆中总黄酮进行提取，静置，过滤，将滤液按“1.3”进行总黄酮含量测定及加标回收实验，每个样品均取3 份，平行测定3 次，取平均值。结果见表2。

表2 样品测定与加标回收实验结果

由表2 可见，所测赶黄草花、叶、杆样品总黄酮得率依次别为：11.09%、9.27%、4.06%，呈现：花＞叶＞杆。所测样品加标回收率均在90%～110%，RSD%≤0.91。表明：测定方法准确、可靠。

2.3 样品黄酮提取物的抗氧化性测定

取样品总黄酮提取液各3 份，分别按“1.4.1”、“1.4.2”进行DPPH·、OH·自由基清除率实验，并用VC 做对照实验，均平行测定3 次，取平均值。结果见表3。

表3 样品提取液对DPPH·和OH·自由基清除率

由表3 可见，花、叶、杆总黄酮提取液对DPPH·和OH·自由基均有良好的清除能力。其中：花、叶、杆样品总黄酮提取液对DPPH 清除率（%）平均值分别为：80.91、73.28、81.16，对OH·清除率（%）平均值分别为：74.48、66.41、80.92，二者均呈现出：杆＞花＞叶。

3 结 论

为探究赶黄草花、叶、杆的药效作用，运用超声辅助-分光光度法优化了赶黄草花、叶、杆中总黄酮提取的料液比、超声时间、超声温度及超声功率等工艺条件及其总黄酮含量测定、并将样品总黄酮提取物对DPPH、羟基自由基进行了清除率实验。结果表明：

1）赶黄草花、叶、杆样品中总黄酮平均得率依次别为：11.09%、9.27%、4.06%，呈现：花＞叶＞杆。所测样品加标回收率均在90%～110%，RSD%≤0.91。表明：测定方法准确、可靠。

2）花、叶、杆样品总黄酮提取液对DPPH·、OH·自由基具有良好的清除能力，均超过66%，且均呈现出：杆＞花＞叶。表明：赶黄草花、叶、杆均有很好的抗氧化性，具有良好的抗病毒、抗衰老等药效作用。