李艳娥，古小彬

（四川农业大学动物医学院，成都 611130）

14-3-3蛋白最先由Moore 和Perez 两位研究人员于牛脑组织提取的神经元蛋白中发现，之后被命名为14-3-3[1]，又称为酪氨酸3-加单氧酶/色氨酸5-加单氧酶激活蛋白[2]，该蛋白广泛分布于动物、植物、真菌等多个物种。近年来，随着对14-3-3蛋白的深入研究，越来越多新的生物学功能逐渐被发现，该蛋白参与多种细胞活动的调节，包括细胞周期控制、细胞凋亡、信号转导、细胞的增殖分化等[3-4]。因此，对寄生虫14-3-3 蛋白功能的研究，可更好的了解其在寄生虫致病过程中所发挥的重要作用，为临床上防治寄生虫疾病提供新的靶标。本文主要对近10年（2013—2023）寄生虫14-3-3 蛋白的结构、定位以及生物学功能的最新研究进展进行综述。

1 14-3-3蛋白的分型与结构

1.1 14-3-3蛋白的分型

在高等真核生物中存在多种14-3-3亚型，且不同的物种之间含有的亚型数目各不相同。如哺乳动物有7种14-3-3亚型，分别用β、ε、η、γ、θ、ζ、σ来表示，而植物的14-3-3 亚型可多达15 种[5]；单细胞或者低等真核生物通常有1-2种14-3-3亚型[6]。

目前已报道14-3-3 蛋白的寄生虫有粪类圆线虫（Strongyloidesstercoralis）[7]、旋毛虫（Trichinella britovi）[8]、弓形虫（Toxoplasmagondii）[9]、犬新孢子虫（Neosporacaninum）[10]、恶性疟原虫（Plasmodiumfalciparum）[11]、溶组织内阿米巴原虫（Entamoebahistolytica）[12]、柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella）[13]等，但它们的14-3-3 亚型数量和类型存在差异（表1）。溶组织内阿米巴原虫至少有3 种亚型[12]；猪带绦虫（Taeniasolium）报道了6 个14-3-3 基因，其中有2 个基因尚未明确其蛋白亚型，故通常认为是4 种亚型[14]。

表1 近十年内报道的寄生虫14-3-3蛋白亚型Table 1 Isoform of parasite 14-3-3 protein reported in the last decade

1.2 14-3-3蛋白的结构

14-3-3蛋白的分子量在25-33 kDa 之间，由247-280 个氨基酸组成[19-20]，其二级结构主要由α-螺旋，β-转角，扩展链和无规则卷曲4 种结构组成[14]，其中α-螺旋结构所占比例最高，其他3种结构在不同种寄生虫中占比不同[9,14,21]。14-3-3 蛋白的三级结构主要以两个反向平行的单体缔合成同源或者异源二聚体的形式存在（图1），依靠Leu、Ala、Ile和Tyr的氨基酸侧链之间的疏水力和静电力驱使两个单体间形成一个“U”形或杯型凹槽[20]，不变残基多分布于凹槽内壁，而可变残基位于凹槽的突出面外壁上[22]，该凹槽具有两亲性，两侧分别携带极性残基和疏水残基构成极性面和非极性面，用于结合靶蛋白上的磷酸化残基[11]。

图1 细粒棘球绦虫14-3-3蛋白各亚型同源二聚体建模3D结构[23]Figure 1 3D structure modeling of homologous dimers of14-3-3 protein isoform of Echinococcus granulosus[23]

2 寄生虫14-3-3蛋白的表达与定位

2.1 寄生虫14-3-3蛋白的表达

吸虫研究发现，14-3-3 蛋白在日本血吸虫（Schistosomajaponicum）的成虫和童虫阶段均有转录表达，但其在毛蚴的表达量高于成虫[24-25]；14-3-3蛋白在麝猫后睾吸虫（Opisthorchisviverrine）的虫卵、尾蚴和成虫阶段具有转录表达，但在成虫阶段的转录表达量最高[26]。

绦虫14-3-3 蛋白主要在猪带绦虫的成虫和囊尾蚴阶段转录表达，但该蛋白不同亚型在不同阶段的表达量存在差异，如14-3-3.1-4在囊尾蚴阶段表达水平更高，且表达量以14-3-3.2、14-3-3.4、14-3-3.1、14-3-3.3 的顺序递减，而14-3-3.5-6 在成虫阶段的表达水平更高[14,27-28]。

14-3-3 蛋白在细粒棘球绦虫（E.granulosus）的棘球蚴阶段的表达量最高[23]。14-3-3 蛋白在旋毛虫的肌幼虫和成虫阶段也都均有转录表达[26]。14-3-3蛋白主要在柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的子孢子和第二代裂殖子阶段转录表达，且表达水平会随着寄生虫的生长而逐渐降低[13,16]。

2.2 寄生虫14-3-3蛋白的定位

吸虫日本血吸虫14-3-3 蛋白分布于虫体的皮层、皮下层、肌层和实质层[24]，且在虫卵内毛蚴的体壁和左右两侧腺体中含量尤其高，体壁是血吸虫生长发育的关键部位，提示14-3-3可能在虫体的生长发育过程中发挥重要作用[29]；而曼氏血吸虫（S.mansoni）14-3-3 蛋白主要分布于成虫的排泄系统和生殖系统，包括在卵黄细胞和卵母细胞的胞浆、胞核中都有分布，同时在尾蚴的皮层和肌层也有分布[30]。

华支睾吸虫（Clonorchissinensis）14-3-3 蛋白天然蛋白则主要分布于成虫的外表面、吸盘和囊蚴的囊壁上，在生殖系统（如精母细胞）中也有部分定位表达[31]。

线虫旋毛虫14-3-3 蛋白主要分布于成虫和童虫的虫体两端[26]。

原虫犬新孢子虫14-3-3 蛋白主要定位于虫体的细胞质和细胞膜，同时还在寄生泡中存在，能够促进寄生泡膜的形成[10,15]；布氏锥虫和溶组织内阿米巴原虫的14-3-3 蛋白定位于细胞质[1,12]；而恶性疟原虫14-3-3I主要定位于成熟裂殖体和游离裂殖子的细胞外围[11]。

3 寄生虫14-3-3蛋白的生物学功能

14-3-3 蛋白发挥其生物学功能多是与其他蛋白结合，通过蛋白间相互作用来实现的。能够与14-3-3 蛋白结合的互作蛋白高达200 多种，包括Raf 激酶，磷酸酶和跨膜受体等[2,32]，14-3-3 蛋白利用其结构凹槽来结合这些磷酸化或非磷酸化配基，通过调控靶蛋白从而参与到寄生虫的生长发育、运动与入侵以及对宿主的免疫调控和信号传导等重要的过程当中。

3.1 14-3-3蛋白调控寄生虫的生长发育

14-3-3 蛋白在大多数寄生虫的生长发育过程中都能表达，其可通过影响酶活性或干扰细胞分裂周期等多种形式来对自身发育进行调控，表明该蛋白在寄生虫的生长发育等过程中至关重要。柔嫩艾美耳球虫14-3-3 蛋白基因与端粒酶逆转录酶的RNA 结合域直接结合，抑制端粒酶活性，对细胞的持续增殖和寄生虫生命周期发挥调控作用[33]；布氏锥虫14-3-3蛋白多以异源二聚体的形式存在，已证明这种形式不仅有助于维持亚型的稳定水平，而且还能有效控制细胞周期和胞质分裂[17]；蓝氏贾第鞭毛虫（Giardialamblia）14-3-3 与肌动蛋白丝的形成有关，除维持G/F-肌动蛋白稳态外，似乎还可能在肌动蛋白复合物的亚功能化中起作用[34]。

3.2 14-3-3蛋白调控寄生虫入侵宿主过程

有关14-3-3 蛋白在寄生虫入侵宿主组织中的作用的报道多集中于原虫，如溶组织内阿米巴原虫的滋养体前缘和伪足部位有大量14-3-3.3（EhP3）富集，推测该蛋白可能与阿米巴原虫的运动性相关，此外，在红细胞附着于滋养体时，EhP3会迅速募集于附着点直至吞噬过程完成，提示该蛋白还可能会参与红细胞的吞噬过程[12]。

恶性疟原虫裂殖子14-3-3I可与宿主的钙依赖性蛋白激酶1（CDPK1）、蛋白激酶A 的调节亚基（PKAr）相互作用形成多蛋白复合物，其中14-3-3作为支架蛋白介导并参与信号复合物磷酸化依赖性组装，从而在疟原虫入侵红细胞过程中发挥作用[11,35-36]；而柔嫩艾美耳球虫14-3-3 蛋白同样可以与CDPK作用，参与球虫对宿主的入侵[13]。

除上述与宿主蛋白酶类发生互作参与入侵细胞过程外，寄生虫14-3-3蛋白还可增加感染宿主细胞的运动能力，如弓形虫14-3-3蛋白大量集中于寄生泡中，且能够诱导寄生性树突状细胞和小胶质细胞的过度迁移，推测14-3-3蛋白在虫体向宿主组织的入侵过程中发挥作用[37]。

3.3 寄生虫14-3-3蛋白调控宿主免疫

多种寄生虫的14-3-3 蛋白都可以调控宿主的免疫功能，其可通过改变宿主分泌细胞因子、NO的产生和抗体水平，以及调控宿主免疫细胞的增殖、凋亡或迁移来调控宿主免疫，但不同种类的寄生虫14-3-3蛋白调控宿主免疫应答存在一定差异。

吸虫大片吸虫（Fasciolagigantica）重组14-3-3ε 蛋白可增强山羊外周血单个核细胞（PBMCs）分泌IL-10，并抑制IL-4、IFN-γ 的分泌，还可促进细胞分泌TGF-β，并在高浓度条件下（80µg/mL）促进NO 产生，同时该蛋白还可明显抑制山羊PBMCs增殖和吞噬能力，且在蛋白浓度为20 µg/mL时促进细胞迁移，在40和80 µg/mL 时抑制细胞迁移，并诱导细胞凋亡[38]。

日本血吸虫14-3-3 蛋白除可促进T 淋巴细胞比例增加外，还显著促进小鼠脾细胞的凋亡[39]。

绦虫多房棘球绦虫（E.multilocularis）重组14-3-3蛋白可改变小鼠血清中IFN-γ、IL-4的分泌水平，诱导小鼠产生Th1/Th2混合型免疫应答[21]；细粒棘球绦虫原头蚴重组14-3-3 蛋白可提高小鼠血清中IL-2的水平和抗体IgG、IgE水平[40-41]。

线虫捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）重组14-3-3蛋白（rHCftt-2）刺激山羊PBMCs分泌IL-10、IL-17和IFN-γ，抑制IL-4和NO的分泌，同时还可促进PBMCs细胞的迁移，但细胞的增殖水平却以剂量依赖性方式显著降低[42]，而旋毛虫重组14-3-3蛋白可促进小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-4 和IL-5水平升高，诱导小鼠Th1/Th2混合型免疫应答[26]。

原虫巨型艾美耳球虫重组14-3-3 蛋白可促进鸡血清中IFN-γ、IL-2、IL-4 和TGF-β4 等细胞因子水平的升高[16]；犬新孢子虫重组14-3-3蛋白以不依赖于TLR2 的方式激活MAPK、AKT 和NF-κB 信号通路，诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-6、IL-12和TNF-α 等细胞因子从而调节小鼠先天性免疫应答[10]，同时还能够增加CD8+T淋巴细胞比例，而在蛋白浓度高于100 µg/mL时显著抑制小鼠腹腔巨噬细胞的增殖[10,15]。

3.4 寄生虫14-3-3作为多种寄生虫疫苗候选抗原

目前已报道有寄生虫14-3-3 蛋白的DNA 疫苗、重组亚单位疫苗和活载体疫苗，其中大部分寄生虫14-3-3蛋白的疫苗进行了保护性效果评价，但它们的保护效果存在差异。

吸虫肝片吸虫（F.hepatica）重组14-3-3蛋白疫苗免疫山羊后，血清中IgG特异性抗体水平升高，但免疫后山羊的肝脏损伤程度与未免疫的山羊接近[43]。

绦虫细粒棘球绦虫14-3-3 亚单位疫苗免疫的小鼠对原头蚴攻击具有85.3%和84.47%的保护力，可显著降低其肝脏和肠系膜处的棘球蚴包囊数目和包囊大小[40-41]，另外，该蛋白与疫苗佐剂MPLA形成的脂质体疫苗可进一步提高宿主对细粒棘球绦虫感染的抵抗力，高达95.07%[44]。

线虫旋毛虫14-3-3 蛋白联合佐剂ISA50v2免疫小鼠，肌幼虫减虫率可达46.2%[26]；捻转血矛线虫重组14-3-3蛋白（rHcftt-2）疫苗免疫的山羊仅产生较弱的保护力，免疫组山羊排出的每克粪便虫卵数（EPG）和蠕虫负荷数较未免疫组相比分别降低26.46%、32.33%，同时减少了宿主血红蛋白的损失[45]；而粪类圆线虫14-3-3重组蛋白亚单位疫苗无任何保护力，免疫后小鼠血清中的IL-10、TGF-β、IL-13 和TNF-α 细胞因子水平虽然升高，但小鼠体内的虫体和虫卵数目甚至还高于未免疫小鼠[7]。

原虫堆型艾美耳球虫（E.acervulina）14-3-3蛋白DNA疫苗免疫的鸡对柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫的单独或混合感染都呈现良好的抗球虫效应，混合感染时抗球虫指数（ACI）可达170.92，鸡群相对体重增加86.82%，卵囊减少率为39.33%，且肠道损伤减轻（病变评分降低3.11±1.08）[46]，巨型艾美耳球虫14-3-3 蛋白疫苗亦呈现良好的抗球虫效应，攻虫后的ACI可达166.96，卵囊减少率75.91%，也可明显降低鸡的肠道损伤评分[16]。

弓形虫重组14-3-3蛋白联合其他蛋白（MIF和CDPK3）组成的鸡尾酒疫苗可有效抵抗致死性弓形虫的感染，其体内包囊减少82.7%，且90%的免疫小鼠可存活[47]，而其14-3-3 蛋白DNA 疫苗虽可延长免疫组小鼠约11天的寿命，但无法抵抗致死性弓形虫感染[48]。

犬新孢子虫重组14-3-3蛋白免疫小鼠后，小鼠体内的虫体负荷量显著降低，组织病变也较轻，可显著延长攻虫后小鼠的寿命，但其存活率仅40%[15]。

3.5 寄生虫14-3-3 蛋白作为潜在的血清学诊断靶标

除上述功能外，14-3-3蛋白还有望被用作寄生虫疾病的血清学诊断。日本血吸虫重组14-3-3 蛋白与其天然蛋白均能够被日本血吸虫感染患者和感染兔的血清识别[49]，旋毛虫重组14-3-3蛋白同样可以被早期感染旋毛虫的猪或小鼠的血清所识别[50]，表明日本血吸虫和旋毛虫重组14-3-3蛋白具有作为血清学诊断靶标的潜力；粪类圆线虫14-3-3蛋白所建立的血清学诊断方法具有较高的灵敏度（96%），且其特异性与市售试剂盒（Novatech）相似，表明14-3-3 蛋白可作为粪类圆线虫的有效候选诊断抗原[51]。

4 展望

随着近些年对寄生虫14-3-3蛋白研究的深入，发现14-3-3蛋白与寄生虫的生长发育和入侵有关，且能够调节宿主免疫反应，其可作为潜在的寄生虫病血清学诊断靶标和疫苗候选抗原。然而，关于寄生虫14-3-3 蛋白在信号通路中的作用报道较少，14-3-3 蛋白在寄生虫致病过程中具体的分子作用机制也尚未阐明，解决类似问题将为寄生虫疾病的防治提供新思路。