李小雨，蒋 进，费德友，王淑荣

（南充市农业科学院，四川 南充 637000）

由小麦条锈菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）、禾谷镰刀菌（Fusariumgramiearium）和白粉菌（Blumeria graminisf.sp.tritici）所引起的三大真菌性病害条锈病（stripe rust）、赤霉病（Fusariumhead blight,FHB）和白粉病（powdery mildew,Pm）是小麦生育期中最主要的病害，严重影响小麦生产。3种病害均为气传性病害，特别是条锈病菌能够随风进行远距离传播，迄今已记载有5次全国范围内的条锈病大暴发，累计造成减产138亿kg，2002年和2017年是最近2次大流行，导致小麦累计减产28 亿kg[1]。赤霉病菌主要在开花期对小麦穗部进行侵染，然后汲取小麦穗部营养，发病严重后会造成籽粒发育不完整产生干瘪形态籽粒，进而导致小麦减产并积累脱氧雪腐镰孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol,NIV）和赤霉烯酮（zearalenol,ZEN）等多种真菌毒素[2-3]。在2001年到2018年的赤霉病流行19年间里，以2012年最为严重，当年全国超过1.5亿666.7 m2小麦面积遭受到不同程度的侵害，其中又以河南省最为严重[3]。小麦白粉病主要侵害小麦叶片及叶鞘，发生严重时也会延展至小麦穗部，基部叶片和叶片正面一般较上部叶片和背面发病重，发病充分时可以导致小麦叶片早枯，影响籽粒灌浆降低千粒重[4]。

以川西平原、川中北和川东北的成、德、绵、南为主的四川小麦种植区是西南麦区的主产大市，据2020年统计以上述4 大市为主的四川小麦播种面积约占西南冬麦区的70%。受到全球气候变暖及极端气候和秸秆还田农作制度改变的影响，条锈病、赤霉病和白粉病病害呈现出日益蔓延并逐年加重的趋势。四川省处在条锈病冬繁区，属亚热带季风湿润气候，冬季以暖冬为主，3—4月扬花期间降雨频繁，多形成阴雨连绵天，适宜的气候条件和地理位置使得四川省小麦三大病害情况愈加严峻[5-8]。选育和利用抗病品种是控制条锈病、赤霉病和白粉病害最经济、有效和安全的手段[9]。因此，加快培育兼具抗条锈病、赤霉病和白粉病的品种是四川小麦育种的主要目标之一。

病原菌与寄主存在有协同进化关系，这使得病原菌新生理小种同样能够不断快速迭代导致品质丧失抗病性，如2009年以条中24（CYR34）为主要的生理小种的出现，导致四川大部分主流品种丧失抗性，并在几年后CYR34 开始成为优势生理小种，与CYR32、CYR33 及桂22-14 成为四川地区条锈病主要流行生理小种[10-13]。目前，国际上已正式命名了83个抗条锈病基因（Yr1～Yr83）、80多个主效抗白粉病基因（Pm1～Pm68、PmG3M 等）以及7 个抗赤霉病基因（Fhb1～Fhb7）[14-16]。小麦条锈病表型分为全生育期抗性（ASR）、成株期抗性（APR）和感病（S）类型，其中Yr5和Yr15等基因能够有效抵御CYR32和CYR34 生理小种的侵染。同样根据抵抗赤霉病菌侵染的不同程度可将小麦赤霉病抗病性分为抗初侵染（TypeⅠ）、抗拓展（TypeⅡ）、抗籽粒侵染（TypeⅢ）、耐病性（TypeⅣ）和抗DON积累（TypeⅤ）5种抗病类型。四川省虽然不是赤霉病及白粉病传统发病区，但研究者在四川小麦主产地发现四川赤霉病菌种群主要以禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌（Fusariumsatcum）为主要生理小种，白粉病菌以V1a、V2、V3a等为主的毒株[17-20]。目前被发现位于3BL染色体上的Fhb1是目前被研究者认为最有效、贡献率最高的抗赤霉病主效基因。随着生理小种的变化，Pm1等许多抗病性基因已经部分或者完全丧失了抵抗白粉病菌侵染的能力，但来自于簇毛麦的Pm21在四川地区小麦育种中仍然被广泛应用。因此，了解当地小麦品种（系）的抗病性及抗病基因携带类型，鉴定筛选出抗病材料对于优异基因的转移利用至关重要。

因此，本研究对来自于南充市农业科学院近年培育的39份小麦品种（系）进行条锈病、赤霉病田间多年鉴定，同时利用与条锈病、赤霉病和白粉病抗病基因连锁的分子标记对供试材料进行检测，明确其抗病性基因组成，筛选出抗条锈病、赤霉病和白粉病的优良小麦品种（系），以期为今后新品种培育和生产示范推广提供材料来源和参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试的39 份材料均为南充市农业科学院近年所培育并保存的小麦品种（系），其中8 份通过四川省审定，其余31份为自育高代品系。条锈病诱发及对照采用铭贤169，赤霉病分别以苏麦3号（高抗）、扬麦158（中抗）和安农8455（高感）作为感病对照。混合生理小种（CYR32、CYR33、CYR34、贵22-14、水源类型等）混合菌，由甘肃省农业科学院植物保护研究所贾秋珍研究员提供。禾谷镰孢悬浮液（F0301、F0609、F0980 和F1312）由江苏省淮安市农业科学研究院提供。

1.2 试验方法

1.2.1 田间抗病性鉴定

条锈病（接种鉴定）和赤霉病（自然发病）田间抗性鉴定于2020—2023年间连续3年在四川省南充市农业科学院试验基地完成。每份材料采用顺序排列方式行播2 行，行长1.2 m，行距25 cm，旁边垂直条播铭贤169 作为诱发及感病对照，并在其四周设置保护行。在小麦分蘖-拔节期时采用混合菌种-滑石粉比例混合涂抹法和喷雾接种结合进行，按照DB51／T713-2007《小麦抗条锈病性田间鉴定技术规程》中关于小麦条锈病调查的要求进行反应型记载。在2022—2023年度里另设置一组赤霉病单花滴注试验。于扬花期使用移液枪对每份材料的10 个单穗的中部进行10 µL 孢子悬浮液滴注，套袋后每日4 次喷水保湿，在接种后的25 d 和30 d 进行记载。按NY/T2954-2016标准记载严重度。1级：无病穗；2 级：1/4 以下小穗发病；3 级：1/4～1/2 小穗发病；4级：1/2～3/4小穗发病；5级：3/4以上小穗发病。

1.2.2 抗病基因检测

小麦植株DNA 提取参照Hill-Ambroz 的改良CTAB法进行[21]。采用20 µL体系进行PCR扩增，其中2× Taq PCR Mix 和所需引物由上海生工生物合成，PCR 程序参照所需标记要求设置，产物在1.5%的琼脂糖凝胶电泳和荧光定量分析。分子标记选用与条锈病（YrAs2388、Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr34/48、Yr36、Yr65、Yr80、Yr81）、赤霉病（Fhb1）和白粉病（Pm21）紧密连锁的SSR 和KASP 等标记进行，具体所用引物序列见表1。

表1 小麦抗病性基因分子标记信息Table 1 Molecular marker information for detection of wheat resistance genes

2 结果与分析

2.1 条锈病田间抗病性鉴定结果

采用混合生理小种（CYR32、CYR33、CYR34、贵22-14、水源类型等）2020—2023年连续3年接种鉴定供试材料成株期条锈病抗性鉴定，从表2 结果可以看出2021年成株期表现为中抗及以上的材料有16份，占供试材料的41%，其中南麦941、南麦995和南麦979 等6 份材料对混合菌种表现为高抗，占供试材料的15.4%；其余23份材料对混合菌种表现为感病（中感和高感水平），占比59%，中感和高感分别有4 份和19 份。2022年成株期表现为中抗及以上的材料有14 份，占供试材料的35.9%，其中南麦941、南麦904和YY-82这3份材料对混合菌种表现为高抗；其余25 份材料对混合菌种表现为感病（中感和高感水平），占比64.1%，中感和高感分别有6份和19 份。2023年成株期表现为中抗及以上的材料有20 份，占供试材料的51.3%，其中南麦941、南麦995 和南麦979 等6 份材料对混合菌种表现为高抗，占供试材料的15.4%；其余19 份材料对混合菌种表现为感病（中感和高感水平），占比48.7%，中感和高感分别有12 份和7 份。南麦941 等11 份材料在连续3年的观察中对条锈混合菌种均表现为中抗及以上水平，占总供试样本的28.2%，这表明所育材料在条锈病抗性水平上还需要有所提高。南麦941 和YY-82 这2 份材料连续3年均表现出高抗水平，表明该材料可以被继续用来作为小麦抗病材料的重要亲本，特别是南麦941 可以在生产上继续推广种植。

2.2 赤霉病田间抗病性鉴定结果

苏麦3 号、扬麦158 和安农8455 均达到对照抗感发病水平，从表2 的连续3年赤霉病自然发病观测结果可以看出，39份材料均没有出现高抗及以上抗赤霉病的品种（系）。与对照相比，南麦941、南麦971、南麦990 和南麦991 在3年未接菌自然发病和单年单花滴注情况下均表现为中抗，南麦995在3年未接菌自然发病表现为中抗，在单花滴注情况下为中感。有10 份材料连续3年表现为中抗及以上水平，占比25.6%。在单花滴注鉴定中，仅有7份材料表现为中抗，比平均3年中抗材料占比下降17.9%；19 份材料为中感与往年相当；13 份表现为高感，相比平均3年高感材料占比提升64.7%。

2.3 田间抗性鉴定综合评价

根据39份供试材料连续3年的条锈病（接种鉴定）和赤霉病（自然发病）以及1年的赤霉病单花滴注鉴定结果显示。所有供试材料中仅有南麦941这1份材料在条锈病达中抗及以上水平且赤霉病鉴定也为中抗，占比2.5%；南麦995这1份材料在条锈病表现为中抗及以上水平且赤霉病自然发病鉴定为中抗水平，占比2.5%；南麦987、南麦979、南麦969、南麦904、南麦619和YY-82等6份材料在连续3年条锈病接种鉴定且连续2年赤霉病自然发病鉴定下综合表现为中抗水平，占比15.3%。

2.4 抗条锈病抗病基因分子标记检测结果

利用已知的Yr基因紧密连锁标记或基因标记对39 份材料进行12 个Yr基因扫描，检测结果如表3。39 份材料中超过一半供试材料可能携带有Yr10、Yr26和Yr65基因，分别占比达到53.8%、61.5%和64.1%；在7份材料中检测到YrAs2388功能基因的目的条带，占比17.9%（图1）；有9份材料检测到Yr5全生育期抗病基因目的条带，占比23.1%；有16 份供试材料检测到Yr9全生育期抗病基因目的条带，占比41%；有5份材料检测到Yr18基因连锁标记条带，占比12.8%；在Yr36抗病基因标记中仅有1 份材料检测到目的条带；此外，Yr15特异分子标记、Yr34/48和Yr80的KASP 分子标记检测结果显示，所有供试材料均不携带有上述3个目的基因；利用Yr81KASP检测结果显示，南麦995 等5 份供试材料可能携带有Yr81抗病基因（图2）。从检测结果来看，除Yr10、Yr26和Yr65基因分布频率较高外，其余抗条锈病基因在整个供试材料中的出现频率均较低。

图1 YrAs2388扩增部分供试小麦品种（系）Figure 1 Amplification of YrAs2388 in some tested wheat varieties(lines)

图2 利用分子标记KASP_3077荧光定量 PCR 检测小麦育成品种(系)中Yr81基因Figure 2 Detection of Yr81 based on real-time PCR using molecular marker KASP_3077 of wheat cultivars and lines

表3 39份育成品种（系）抗病基因分子标记检测Table 3 Detection of resistance gene in 39 wheat varieties (lines)

2.5 抗赤霉病Fhb1分子标记检测结果

为提高抗赤霉病Fhb1基因的检测结果准确性，我们同时利用该基因的诊断性标记His3B-4和功能基因标记TaHRC-GSM对39份供试材料进行双向验证检测是否携带有Fhb1。PCR检测结果显示，除阳性对照苏麦3号外，所有材料均未能扩增出1 309 bp和1 400 bp目的条带，这说明严重缺少抗赤霉病Fhb1基因的资源材料，在今后的培育工作中需要加强该基因的转移利用。

2.6 抗白粉病Pm21分子标记检测结果

在小麦的抗白粉病应用中，Pm21基因是目前应用最多的广谱抗病性基因。利用Pm21抗病基因的标记CINAU-NLR对所有材料进行检测，以绵麦367为对照，所有供试材料中仅有南麦660等6份材料扩增出477 bp的目的条带，占比15.4%，其余材料均未扩增出目标条带（图3）。

图3 Pm21扩增部分供试小麦品种（系）Figure 3 Amplification of Pm21 in some tested wheat varieties (lines)

3 讨论

3.1 抗病基因转移利用在南麦系列材料中的重要地位

四川省是中国重要的条锈病策源地和条锈病菌冬繁区，由于其特殊的地形和气候条件，使得其不仅是条锈病的发病地也是条锈病流行区[12]。小麦种植大市南充市位于四川东北部，是典型的丘陵区，该地处于嘉陵江流域，冬季气温偏高且空气湿度较大，近几年的气候条件均有利于条锈病菌的萌发和侵染[6]。基于条锈病高发现实情况，条锈病抗性选育一直是南麦系列选育新品种的硬性条件之一。从本研究的结果来看，南麦系列的小麦品种（系）具有较好的条锈病抗性。从多份材料中检测出Yr9、Yr10和Yr26等全生育期抗性基因，并且有多份材料在田间条锈病接种鉴定中表现出连续多年的中抗及以上水平。CYR34（V26）作为新的致病生理小种出现引起条锈病菌的流行，这使得以Yr10和Yr26等为主的抗病基因的携带品种开始逐步丧失抗病性[37]。研究中发现虽然CYR34对Yr10和Yr26具有联合毒性，但Yr5、Yr15、Yr11-14、Yr16和Yr18等基因能够减弱CYR34的侵染程度，特别是来自于野生二粒小麦G25的Yr15基因能够抵御超过3 000个条锈病生理小种的侵染[13,38]。在本研究中，39 份材料均未检测到Yr15基因，Yr5和Yr18基因也仅分别检测到9 份和5 份携带有。目前，南充小麦抗病育种可用抗源严重匮乏，进一步引进筛选的新的抗病基因资源并应用于抗条锈病育种，是实现南麦系列抗条锈病整体水平提升的重要途径。因此，在今后小麦培育中南麦系列品种培育应当加强Yr15等广谱抗性基因的筛选和转移利用。

本研究中所选取的39份材料，有一部分是已经通过审定的品种，其余部分为高代或者中间材料，通过对供试材料进行条锈病、白粉病和赤霉病进行分子标记检测，以南麦941 为首的部分材料虽然检测出多个抗条锈病基因和抗白粉病Pm21基因，但未检测到抗赤霉病Fhb1基因。分析其原因，可能是由于前几年在小麦扬花期间晴朗天气频率高，赤霉病发病率和严重度低，使得作为非传统赤霉病高发区缺乏自然选择压力和较低的人为选择关注度。因此，培育出的材料大多缺乏赤霉病抗性基因Fhb1。在四川小麦品种抗病研究中，邓清燕等[39]从156 份材料中筛选到1份高代材料中携带有Fhb1基因，张华等[40]从153份四川主推品种和后备材料中也仅筛选到12份材料可能携带有Fhb1基因。Fhb1是目前报道出抗赤霉病最强并且最稳当的赤霉病抗病基因，被广泛应用于育种和科学研究中。Fhb1基因主要来源于苏麦3号和宁麦9号等材料及其衍生后代，以苏麦3号为主的衍生后代中有些材料表现出产量较低、高秆等不利的农艺性状，以宁麦9号为主的衍生后代宁麦、扬麦和镇麦等材料在综合农艺性状上有较大提升[41-43]。本研究通过诊断性标记His3B-4 和功能基因标记TaHRC-GSM相结合的方式进行验证筛选，均未发现可能携带有Fhb1基因的材料。因此，想要快速提高南充小麦赤霉病品种的选育，可以选择从河南、江苏等赤霉病高发区引进综合性状较好的抗病品种进行转移利用。

3.2 利用分子标记促进南麦系列材料抗病基因的聚合

历史事件表明，单一抗源条锈病基因的品种在生产中进行大面积使用，在短时期内虽然能够取得良好的防治效果，但由于条锈菌生理小种的快速变异，一但新毒性小种的出现常会导致单一抗性品种在生产中快速“丧失”抗病性，也能够加速新毒性小种占据成为优势生理小种，引发区域内条锈病大爆发[10,44]。在检测结果中，荣春南麦1号和特研麦88 虽然携带有全生育期抗性基因Yr5，但在连续3年接种鉴定中均为高感。我们推测可能是田间菌源丰富，致使个别单基因品种难以克服多个混合小种。因此需要加强多基因聚合来提高对混合小种的侵染。采用分子标记辅助选择（marker-assisted selection，MAS）手段在进行资源鉴定和育种选择时可同时达到高效率与高精准双要求。李静静等[45]利用MAS 快速创制出携带有苏麦3 号Fhb1基因的20 个新品系；高月等[46]利用MAS 将金禾9123、普冰01 和良星99 中的抗白粉病Pm21、Pm35和Pm25快速聚合至后代材料中。本研究通过抗病基因的分子标记快速鉴定出所有供试材料可能携带抗病基因类型情况，虽然检测出24 份材料同时携带有3 个以上抗条锈病Yr基因，但均缺乏Yr5、Yr15、Yr18及YrAs2388这些全生育期、成株期广谱抗性多基因聚合类型。以南麦941为代表的材料聚合有（YrAs2388+Yr10+Yr26+Yr65）4个抗条锈病基因，该材料在田间观测中连续3年均为高抗条锈病，故在今后培育中可以进一步利用MAS 将广谱抗性基因Yr15和赤霉病主效基因Fhb1聚合到南麦941 这一系列优异材料中。本研究中对12 个抗条锈病Yr基因和1 个赤霉病Fhb1及1 个白粉病Pm21基因进行功能标记或者紧密连锁标记检测，从检测结果上看，这些基因都能够通过相应的标记进行快速识别。因此，在今后南麦品种培育中，可以使用条锈病、赤霉病和白粉病基因相关标记进行辅助选择促使品种同时聚合多个抗病基因类型。

3.3 39份南麦系列材料中可能携带有未知抗病基因

Yr9和Yr10等基因已经丧失了对CYR34（V26）小种的抗性，仅对小部分生理小种具有一定抵抗[37,47]。在本研究中，从南麦619 中检测到Yr9和Yr10两个条锈病基因，但在3年混合接种鉴定中均表现出中抗水平。由此我们推测在南麦619中可能还携带有其他抗条锈病基因未被检测到。单一的条锈病基因或许已经丧失抗性，但当多个微弱基因聚合在一起的时候可能会产生加性效应，能够表现出抗病性[47]。在检测中我们还发现南麦660 和南麦904 两份材料均同时仅携带有Yr10和Yr65两个微弱基因，但这两份材料在连续3年接种鉴定中鉴定为中抗和高抗，原因可能是抗性基因Yr10和Yr65表现出抗性水平，也可能是这些基因组合存在加性效应或上位效应，抑或是由于该种质携带其他未检测到的已知或新的抗性基因存在。

目前对于赤霉病的遗传研究，国内外已经定位到近100 个与赤霉病相关的QTL，这些位点在各个染色体上均有分布，其中仅有7 个Fhb1-Fhb7被正式的命名，其中Fhb1是被认为最好的抗赤霉病基因[48]。在本研究中，南麦941、南麦971、南麦990 和南麦991 在3年自然发病鉴定和1年单花滴注鉴定中均表现为中抗表现，但这4 份材料在诊断性标记His3B-4 和功能基因标记TaHRC-GSM检测下均未发现Fhb1基因目的条带。我们推测可能在这些材料中还存在有其他未检测的FHB基因类型。

4 结论

在四川盆地条锈病传统高发区、赤霉病日益频发状态下，本研究利用流行的混合生理小种（CYR32、CYR33、CYR34、贵22-14、水源类型等）和赤霉病孢子悬浮液滴注对39 份南麦系列品种（系）进行田间抗病性鉴定，获得南麦941 和南麦995 等6 份高抗稳定材料；南麦941和南麦971等4 份中抗赤霉病稳定材料。利用已知的12 个条锈病抗病基因分子标记检测供试材料，Yr9、Yr10和Yr26分布频率较高，Yr15广谱抗性基因均未检测到。因此，应当加强对Yr15基因的转移聚合。检测到南麦941等7 份携带有YrAs2388基因，南麦995 等9 份携带Yr5基因，这些材料可以进一步作为条锈病抗性基因转移利用资源加以利用。39 份材料赤霉病分子标记检测结果现在均未携带Fhb1基因，但有部分材料田间观察中均表现为中抗赤霉病，如南麦941 和南麦971 等4 份材料，可进一步加强对该材料抗源和抗性基因的挖掘，结合分子标记辅助选择应用于小麦育种中。