单振刚 羊华龙 杨乐东 黄杰庭 王敏 许茹 廖峭 钟惠珊 刘博超 付涌水, 戎霞△

(1.广州血液中心,广东 广州 510095,2.南方医科大学南方医院)

新冠病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒2 型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2) 的简称[1-2]。大多数新冠病毒感染者表现为无临床症状或仅有轻微症状,但部分人如有基础疾病的老年人感染后可能出现呼吸困难、持续胸痛、高烧、意识模糊等严重症状甚至危及生命[3]。我国«新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)»明确指出康复者恢复期血浆可用于病情进展较快的重型和危重型患者[4],同时有关部门也要求各地采供血机构做好新冠康复者恢复期血浆供应工作。因此,了解无偿献血者体内不同时间段新冠病毒抗体水平,对于进一步采集含有高效价抗体血浆,服务新冠感染救治工作有着重要意义。本研究采用酶联免疫吸附法(ELISA)在广州地区的无偿献血者中开展新冠病毒IgG、IgM 以及中和抗体的检测分析,为恢复期血浆采集和临床使用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机选取2023 年2—7 月在广州血液中心献血且所有检测项目均合格的无偿献血者血液标本1 168份。其中326 份(2023 年2 月献血)检测IgG 抗体,398 份(2023 年7 月献血)同时检测IgG 和IgM 抗体,444 份(2023年2 月献血)检测中和抗体。

1.2 试剂与仪器 新型冠状病毒(2019-nCoV)IgM/IgG 抗体检测试剂盒(北京华大吉比爱公司,批号20230102,IgM 检测原理为ELISA 捕获法,IgG 检测原理为ELISA 间接法),新型冠状病毒(2019-nCoV)中和抗体测定试剂盒(北京华大吉比爱公司,生产批号20221202,中和抗体测定原理为竞争法ELISA,测定方法溯源至WHO Reference Panel,NIBSC code:20/268),Microlab STAR-8CH 全自动加样仪(HAMILTON 公司)、Multiskan MK3 酶标分析仪(Thermo Fisher 公司)、高通量全自动酶免仪(深圳爱康公司)

1.3 方法

1.3.1 IgG 抗体检测 根据«新冠肺炎康复者恢复期血浆临床治疗方案(试行第三版)»,新冠病毒IgG 抗体定性检测呈阳性且160 倍稀释后按照试剂说明书要求检测仍为阳性反应的血清/血浆符合采集标准。因此本研究中所有血浆标本在IgG 检测前均使用生理盐水稀释160 倍。

1.3.2 IgM 抗体检测 IgM 抗体检测使用未经稀释的血浆,所有操作均按照试剂盒说明书进行。IgM 抗体阳性的血浆送第三方医学检验公司做新冠病毒核酸检测,同时对献血者进行随访。

1.3.3 中和抗体检测 中和抗体检测使用未经稀释的血浆。试剂盒定量检测的线性范围为(0.1～10)μg/mL(校准品浓度分别为0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL,1 μg＝160 IU),结果高于线性范围的一律计为10 μg/mL,结果低于0.06 μg/mL(空白限)的则计为中和抗体阴性。

1.4 统计学分析 实验数据使用SPSS 22 进行统计分析,图表绘制使用Microsoft Excel 2016。计数资料组间比较采用卡方检验,计量资料组间比较采用秩和检验,以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 献血者一般情况 见表1。

表1 研究人群的基本情况(n,%)

2.2 献血者新冠病毒IgG 抗体检测结果 见表2。

表2 献血者新冠病毒IgG 抗体检测结果

2.3 献血者新冠病毒IgM 抗体检测结果 2023 年7 月采集的398 份血液标本经检测有5 份为IgM 反应性,反应性率1.26%,随访发现4 位献血者曾经出现过新冠感染临床症状,但在本次献血前后没有身体不适,见表3。

表3 IgM 抗体检测反应性献血者基本情况

2.4 献血者新冠病毒中和抗体检测结果 444 份血液标本中有440 份检出中和抗体,反应性率99.10%。不同性别及不同年龄段间的中和抗体浓度无差异(P>0.05),71.59%的反应性献血者的中和抗体浓度达到或超过试剂盒检测上限,见表4。中和抗体定量的分布情况见图1。

图1 献血者新冠病毒中和抗体定量分布

表4 献血者新冠病毒中和抗体定量结果

3 讨论

新冠病毒感染人体后可以引起广泛的体液免疫应答,产生多种抗体[5]。抗体检测在识别机体感染状态,评估人群感染水平、再感染风险以及治疗和管理效果等方面有着至关重要的作用[6],含有高效价(中和)抗体的恢复期血浆还可用于新冠重症、危重症患者的救治。鉴于目前大量献血者为新冠感染的康复者,因此我们在广州地区的无偿献血者中开展新冠病毒抗体的检测分析。

自国家卫健委宣布对新冠病毒感染实施“乙类乙管”以来,广州地区的感染率上升较快。在我们的研究中,55.11%的献血者体内可以检出IgG 抗体,考虑到血液标本在检测前已经预先使用生理盐水稀释了160 倍,实际的感染率可能更高。7 月份的IgG 检出率达79.4%,显著高于2 月份,这说明广州地区人群中大部分人都已经感染了新冠病毒,且其中部分人可能感染了不止1 次,重复感染导致体内IgG 水平升高。

有研究指出新冠病毒感染者抗体水平可能与性别有关,该研究比较了127 名男性感染者和204 名女性感染者,发现女性在发病早期,体内IgG 水平高于男性,并且在重症患者中女性的IgG 水平也高于男性[7],这说明性别可能是导致新冠病毒感染不同结果的原因之一。不过该研究同时显示在轻度、一般以及康复患者中未发现IgG 水平存在性别差异,这与我们的研究结果是一致的。另一个影响抗体水平的因素是病情严重程度,多个研究均发现重症、危重症患者的IgG水平高于非重症患者[8-9]。由于无偿献血排除了60 岁以上老人等有新冠重症风险的人群,因此在我们的研究中未发现年龄与IgG 水平存在关联。

新冠病毒感染者在恢复期有2 种血清学转换模式,即IgG＋/IgM＋和IgG＋/IgM－。有研究指出血清学转换模式受年龄影响,该研究分析了172 名处在恢复期的感染者发现IgG＋/IgM＋组老年人占比更高(P<0.05)[5],我们的数据也支持这一结论。本次研究我们对398 名献血者(平均年龄32.5岁)进行了IgM 抗体检测,共发现了5 名IgM 反应性献血者。5 人平均年龄45.8 岁,高于整体平均年龄。对5 份IgM 反应性血浆进行新冠病毒核酸检测,结果为阴性。由于献血者IgG 检测呈反应性且在献血前后未出现明显不适,因此该5名献血者大概率处于感染恢复期。本次研究中核酸检测使用的是血浆标本,未使用鼻咽拭子,因此无法确定献血者体内病毒是否已经完全清除,但血浆中未检出病毒核酸也说明恢复期血浆传播病毒的可能性很低,恢复期血浆输注不会对血液安全造成影响。实际上即使从血液中检测到核酸,也不意味着新冠病毒可以通过输血传播。法国1 项研究调查了268 份献血后回告标本,发现其中有3 份为新冠病毒核酸阳性,然而不论是直接做病毒培养还是经超离心后再培养的结果均为阴性,这说明检测到的核酸可能仅为片段化的病毒RNA 或没有完整病毒颗粒的RNA[10]。由于尚未发现输血传播病例,因此目前认为输血传播新冠病毒的风险很低[3,11]。

新冠病毒是1 种有包膜的RNA 病毒,其基因组有14 个开放阅读框,可以编码刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)以及核衣壳蛋白(N)等多种蛋白。位于刺突蛋白(S)上的受体结合域(RBD)能识别细胞表面受体血管紧张素转化酶(ACE2)进而感染宿主细胞。通过特异性识别RBD 阻断病毒与宿主细胞ACE2 结合的抗体称为中和抗体[12-13]。本研究发现广州地区献血人群的新冠病毒中和抗体检测反应性率接近100%,同时中和抗体水平也很高,71.59%的献血者的中和抗体浓度≥10 μg/mL,这可能与广州地区较高的疫苗接种率以及较早解除管控有关。付春燕等[14]检测了349 例新冠灭活疫苗接种者的血清中和抗体水平,发现在第3 剂后150 d 中和抗体检测的反应性率仍然为100%。郭楠等[15]随访了未接种疫苗的新冠康复者,发现在出院后12 个月时中和抗体检测反应性率为94.12%,可见较高的疫苗加强针接种率或新冠病毒感染率均会提升人群的中和抗体水平。本研究中IgG 抗体检测反应性率低于中和抗体检测反应性率可能是血浆稀释倍数不同造成的,IgG 抗体检测使用的是稀释后的血浆,而中和抗体检测使用的是未经稀释的血浆。由于宿主体内存在的干扰物如类风险因子、嗜异性抗体、补体等以及新冠病毒与其他冠状病毒的免疫交叉反应都会影响抗体检测的准确性[6,16],所以也不排除中和抗体有假反应性的可能。此外实验方法及试剂批次的不同也会对检测结果产生一定影响。试剂方面,本研究所用的抗体检测试剂均基于新冠病毒原型株开发,该批次试剂对于感染新冠病毒不同变异株的个体的检测性能可能会有一定差异。方法方面,有文献指出衡量血浆中和潜力的公认标准是活病毒中和实验[17],而替代病毒中和实验(sVNT)的灵敏度仅有前者的80%[18]。欧洲1 项研究比较了5 种中和抗体发光检测试剂与噬斑减少中和实验(PRNT)的检测结果,发现相关性最高0.872,最低0.799[19]。蒋国润等[20]使用ELISA(以S 蛋白为抗原)和微量细胞中和试验分别测定新冠灭活疫苗临床试验血清标本的中和抗体滴度,发现二者相关系数为0.494。陈维欣等[21]比较了ELISA、CLIA 和NT(中和实验) 3 种方法检测新冠疫苗免疫后抗体水平的一致性,发现ELISA 与NT 定量结果的相关系数为0.69,CLIA 和NT 定量结果的相关系数为0.65。这提示我们在分析中和抗体的检测结果时必须考虑实验方法与试剂的影响。本研究中仅使用1 种ELISA 试剂对中和抗体进行了定量检测,具有一定局限性。另外需要指出的是中和抗体检测目前没有统一的计量标准,例如本研究的中和抗体定量中位值为10 μg/mL,而胡欣等[22]测定新冠恢复期男性患者血浆的中和抗体效价中位数为1124.7 AU/mL,2 个检测结果难以直接对比。因此抗体定量值只能作为评估恢复期血浆中和能力的参考,其准确性还有待进一步验证。

综上,广州地区无偿献血人群在新冠病毒大规模流行后有较高的新冠病毒抗体水平,充分具备为临床救治工作提供高效价抗体血浆的条件。但临床使用效果如何以及是否需要根据使用情况动态调整采集标准还需要多中心大样本研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。