晏晓晨 马莉 王宗奎 李长清 雷婷婷 杜晞 叶生亮

(中国医学科学院北京协和医学院输血研究所,四川 成都 610052)

静注人免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin,IVIG,pH4.0),主要成分为免疫球蛋白G(IgG),广泛应用于各种免疫缺陷性疾病、炎症疾病和自身免疫疾病的治疗[1-3]。IVIG含有的针对外源性病原以及自身抗原的广谱IgG 抗体,是其治疗多种疾病的关键因素之一[4]。不同血液制品厂家原料血浆的采集地域、人口遗传因素、制备工艺、病毒灭活工艺等差异,会影响制品中IgG 的抗体种类、数量以及分子结构,从而影响制品的生物学功能和临床治疗的有效性[5-7]。研究表明不同厂家IVIG 制品中IgG 识别模式病原微生物蛋白质的数量以及种类有明显差异[8]。相对于针对病原的抗体,IgG自身抗体在IVIG 治疗免疫炎症和自身免疫性疾病中发挥的作用更加重大[9]。但目前国内外尚缺乏关于IVIG 自身抗体谱研究,以及抗体谱差异与疾病疗效关系的临床数据报道。随着蛋白质组学的发展,利用新技术开展IVIG 中IgG 抗体多样性研究,进一步了解制品的独特性、有效性差异至关重要[10]。

本研究以我国4 个厂家IVIG 为研究对象,首先,以人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)总蛋白为抗原库,采用双向电泳结合免疫印迹杂交技术,展示了4 个制品的自身IgG 抗体谱,其次,利用蛋白质芯片技术,将IVIG 与包被了近20 000 个重组人蛋白的人类蛋白质组芯片杂交,检测了制品中IgG 识别的自身抗原种类和多样性,报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HUVEC 购自上海中乔新舟公司,人IVIG 制品4 份,由国内4 个血液制品企业A、B、C、D 生产并赠予,分别标号IVIG-A、IVIG-B、IVIG-C 和IVIG-D,4 个制品均已通过生物制品批签发且在产品有效期内。HuProtTM人类蛋白质组芯片,美国CDI Laboratories 公司生产,覆盖有23 136 种人类全长蛋白质。

1.2 试剂与仪器 细胞培养用FBS(批号NT9670B)、青霉素-链霉素溶液(批号 R190726CE)、 RPMI-1640 (批号WH190730CE)、 PBS ( 批号 W190820CE)、 胰酶( 批号69090400)为北京EallBio 公司产品,pH4-7 线性等电聚焦预制胶条(17 cm,批号64085073) 、pH3-10 两性电解质(批号64024281)、 Chaps(批号64066971) 均购自美国Bio-Rad公司,0.45um PVDF 膜(美国GE 公司,批号A10122278),辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG Fc 单克隆抗体(美国Abcam 公司,批号GR169991-2),辣根过氧化物酶化学发光底物(美国Thermo 公司,批号P7207587A),细胞培养箱(美国Thermo 公司,HERAcell 2401),倒置显微镜(日本Olympus 公司,CKX31),离心机(美国Thermo 公司,Biofuge Stratos),等电聚焦仪(Protean IEF Cell)、蛋白电泳系统(Protean Ⅱxi Cell),半干转印槽(美国Bio-Rad 公司,Trans-Blot SD),蛋白凝胶扫描仪(Power Look 2100XL,美国UMAX 公司),化学发光成像仪(美国GE 公司,ImageQuant LAS4000 mini),芯片扫描仪(美国Axon 公司,GenePix 4000B),分析软件(美国Axon公司,GenePixTM Pro v6.0)。

1.3 HUVEC 的培养及总蛋白提取 用含有10% FBS 的RPMI-1640 培养基,在37℃,5% CO2,95% 饱和湿度条件下培养细胞并传代,当细胞到达合适细胞量时收集细胞,加入蛋白提取液(8M 尿素,40mM Tris,1% NP40)裂解细胞,收集裂解液上清液即为HUVEC 总蛋白提取液。蛋白提取液经BCA 法进行蛋白定量后分装,－70 ℃冻存待用。

1.4 IVIG 针对HUVEC 总蛋白的IgG 抗体谱实验 HUVEC总蛋白的双向电泳(2-DE)和免疫印迹杂交(Western Blot)实验参考本实验室建立的IVIG 及血浆制品针对大肠杆菌的抗体谱展示方法[8,11],并做了部分实验条件的调整,主要流程及条件为:HUVEC 总蛋白提取液1～1.5mg 上样于pH4～7 非线性等电聚焦胶条(长度17 cm)上进行聚焦(10 000V,60 000 VH),聚焦后的胶条固定于20cm 10% 聚丙烯酰胺凝胶上端,进行第二向SDS-PAGE(200V,8h)。电泳结束后,立即用考马斯亮蓝染色并扫描图像,判断分离效果,或电泳结束后进行Western Blot 步骤:将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白点转到甲醇活化的PVDF 膜上,经BSA 溶液封闭后,依次与IVIG 制品、稀释的辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG Fc抗体(1﹕2 000)孵育。最后将膜与辣根过氧化物酶化学发光底物孵育后,用化学发光成像仪采集图像结果,获得抗体谱。

1.5 IVIG 与人自身蛋白质芯片杂交实验 将HuProt 芯片浸入封闭液(含5% BSA 的TBS-T 缓冲液pH ＝7.5)封闭,待测IVIG 制品用5% BSA 的TBS-T(pH＝7.5)稀释2 000 倍,与芯片在杂交盒中孵育1 h 后,向杂交盒中加入稀释的二抗(Anti-IgG-Cy3),室温避光孵育1 h,利用GenePix 4000B 扫描仪于532 nm 处扫描芯片,获得芯片图像。利用GenePixTM Pro v6.0 软件读取芯片图像原始数据。

1.6 IVIG 自身抗体谱图像分析 利用2-DE 图像分析软件PDQuest 8.0(Bio-Rad)对IVIG 制品自身抗体谱进行分析。

1.7 生物信息学分析 利用软件Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)v6.8 对IVIG 制品中IgG 抗体识别的蛋白,以及不同IVIG 制品差异识别的自身抗原蛋白信息在蛋白功能注释、细胞定位等多个层面进行生物信息注释和分析。

2 结果

2.1 HUVEC 总蛋白2-DE 分析 HUVEC 经传代培养后裂解获取总蛋白,作为与IVIG 进行免疫印迹杂交实验的自身抗原库。HUVEC 总蛋白经pH 4～7 非线性等电聚焦和20cm 10% SDS-PAGE 后染色,扫描图谱见图1。图谱显示,HUVEC总蛋白质得到了较好的分离展示,蛋白点重叠情况较少,利用双向电泳图像软件分析,能够清楚识别的蛋白质点超过650 个。电泳结果能够用于进一步的抗体图谱实验。

图1 考马斯亮蓝染色的HUVEC 蛋白质组二维电泳图谱

2.2 4 种IVIG 针对HUVEC 总蛋白的抗体谱展示 根据建立的实验方案,对4 个厂家的IVIG 制品的IgG 抗体谱展示如图2 所示。图谱显示,杂交斑点位置清晰,交连情况少,易于分析。4 组IVIG 制品均能够识别大量HUVEC 蛋白质,识别的抗原分布于pH4～7,20～150 KD 之间,不同厂家制品针对HUVEC 蛋白质的抗体谱各具特点,且有明显差异,具体表现在识别抗原的数量和种类方面。IVIG-B、C 识别数量相对较多,免疫杂交信号更清晰,D 杂交图谱在pH6～7,50～100 KD区域识别蛋白相对较少,A 在pH5～6,30～50 KD 区域识别蛋白相对较少。

图2 国内4 个厂家IVIG 制品针对人自身抗原(HUVEC 蛋白质组)的IgG 抗体谱

利用二维电泳分析软件分析图谱,并对杂交点数量进行计数,4 个制品识别的HUVEC 蛋白质数量分别为241、364、386 和309 个(表1)。

表1 国内4 个厂家IVIG 制品针对人自身抗原的IgG 抗体谱免疫杂交斑点数量

2.3 芯片杂交 将待测的IVIG 样品稀释后,与重组人蛋白质的芯片杂交,杂交芯片使用GenePix 4000B 扫描仪进行扫描,获得芯片图像,如图3 所示(局部举例)。蛋白质芯片实验结果4 个IVIG 制品分别与重组人蛋白质芯片杂交,杂交图像经软件收集信号,信号数据经数据归一化、标准化处理,设置检出蛋白阈值,筛选出两重复均满足阈值的蛋白作为检出蛋白。最终确定4 个制品分别识别的自身抗原数量为292～435 个(表2)。

表2 国内4 个厂家IVIG 制品识别人蛋白质芯片上蛋白质点的数量

图3 IVIG 与人类蛋白质组芯片杂交信号扫描图(局部)

总体来讲,本实验选择的4 个厂家IVIG 中均含有针对人自身蛋白的广谱抗体,但4 个制品识别的蛋白数量各不相同。与抗体谱实验中得到的IVIG 针对人HUVEC 总蛋白的IgG 抗体谱免疫杂交斑点数量(表1)相比,不同IVIG 识别蛋白点的数量趋势相对一致,识别蛋白最多的是IVIG-C,其次是B,D 和A。除IVIG-D 外,其他3 个制品在芯片实验中识别的抗原点的数量均多于在抗体谱展示实验中识别HUVEC蛋白质点的数量。

为进一步分析我国不同厂家IVIG 制品自身抗体种类与含量异同,我们对4 个制品识别的人自身抗原进行了两两比较分析,计算各制品与芯片上对应蛋白质点反应的归一化信号值比值,组间差异识别的蛋白信号值必须满足比值≥1.2或≤0.833(即1/1.2)。结果采用Venn 图展示如图4 所示。4 个IVIG 制品共识别芯片上623 个人重组蛋白,但不同制品能够识别人自身抗原的种类和结合自身抗原的抗体含量有很大差异,仅有172 个人自身蛋白被4 个制品均识别,且结合各制品IgG 抗体含量无差异。

图4 Venn 图展示4 个IVIG 制品中IgG 结合人蛋白组芯片上的抗原种类及含量的异同

2.4 IVIG 识别的自身抗原的生物信息学分析 本实验4 个制品检出蛋白功能注释分析如图5 所示,4 个制品识别的蛋白功能主要集中在转录、信号转导、RNA 加工和修饰、细胞骨架、翻译后修饰等方面。相互比较发现,在各功能分类下,各制品识别抗原数量各不相同,反映出不同IVIG 制品识别的蛋白质的功能不同。制品A、B 和C 识别的人自身抗原的COG 功能分布图相对一致。对各制品检出蛋白的生物学过程分析统计结果表明,制品A、B 和C 识别的人自身抗原主要参与mRNA 代谢、加工,RNA 剪接、稳定性调控,细胞酰胺代谢过程等过程,而制品D 识别的蛋白主要参与生物之间的种间相互作用,质膜内陷,酰胺合成、代谢,细胞吞噬及mRNA 代谢和RNA 剪接等过程,与其他3 个制品有较大差别。对各制品检出蛋白的细胞成分分析统计结果表明,目标蛋白多集中于细胞核(核腔、核质、核仁)、非膜界细胞器、核糖核蛋白颗粒、细胞骨架和细胞质应激颗粒等。蛋白的分子功能富集分析结果表明,目标蛋白主要为与RNA、特异性蛋白域、细胞骨架蛋白、肌动蛋白以及免疫球蛋白受体等结合的结合蛋白。

图5 IVIG 制品识别蛋白COG 功能分类分布图

3 讨论

IVIG 是以数千个供体的混合血浆为原料提取的血液制品,包含了针对外来病原以及自身抗原的广谱IgG 抗体,与治疗性单克隆抗体相比,它们包含了广泛的反应性[12-13]。其含有大量在人体生理过程中有重要的作用的自身抗体,在自身免疫性疾病和炎症性疾病的治疗中发挥着重要的作用,如:清除衰老细胞,抗肿瘤,抗炎以及介导免疫信号转导等[14-15]。有临床研究表明,不同品牌、不同地区厂家生产的IVIG 在治疗同种疾病时的疗效是存在差异的,不同IVIG 临床治疗时的副反应也各不相同,可能与IVIG 制品的成分、IgG 种类差异有关[16-18]。由于不同血液制品厂家献浆人员的遗传背景,生活的地理区域和环境差异,会影响原料血浆中抗体多样性[8,11],IVIG 制造工艺的差异,也会影响制品的生物学功能,不同IVIG 制品中IgG 抗体识别抗原的差异[7,19]。我们的前期实验研究了我国多个血液制品企业IVIG 针对特定病原抗原库的IgG 抗体谱情况,发现不同IVIG 制品IgG 抗体差异显著[8]。

本研究建立了IVIG 针对人自身细胞抗原库的IgG 抗体谱(自身抗体谱)的展示方法,并对4 个厂家IVIG 自身抗体谱进行了展示、分析。通过抗体谱展示技术,能够通过直观观察及利用分析软件分析差异抗原的数量、在图谱中的位置,也可用于进一步结合质谱实验分析识别抗原的种类,实验中4 个IVIG 制品的中IgG 识别HUVEC 蛋白的数量和种类都明显差异。利用人自身蛋白质芯片杂交实验,进一步确定4 个制品针对重组人蛋白库的抗体种类数量差异,结果与抗体谱实验一致。利用生物信息学方法对蛋白芯片上IVIG识别的重组人蛋白质进行分析发现,IVIG 与细胞质和核蛋白结合最强烈,这与Washburn,Bussone 及Wymann 等团队发表的数据一致[20-22]。

近年来,国家食品药品管理局要求国内的血液制品厂家在新的IVIG 注册申报时,提供制品中抗体多样性分析,但没有规定明确的方法。本实验建立的抗体谱展示分析方法,可以进一步完善IVIG 评价技术体系,应用于国内各企业,为血液制品生产企业关于产品质量内部质控及工艺开发提供技术支撑,也有助于国家食品药品管理局对新的IVIG 的评估,实验结果展示了不同IVIG 中含有的与临床治疗密切相关的IgG 抗体情况和不同厂家IVIG 自身抗体谱的独特性,将为指导临床更好地选择用药奠定基础,通过高通量鉴定分析IVIG中抗体的种类,并对IVIG 中抗体信息的深度挖掘,将为揭示IVIG 治疗各种疾病的作用机理及开发新适应症提供了新的策略和切入点。本研究还存在一定局限性,研究是初步的,对于治疗的影响、疗效机制的研究,还需要在这些数据的基础之上,采取更多与临床的结合以及更多样化的研究来确定和验证。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。