李彭银,陈少青,王建浩,倪昕晔*,王车礼

(1.常州大学药学院 生物与食品工程学院,江苏 常州 213164;2.南京医科大学 附属常州第二人民医院 放疗科,江苏 常州 213003;3.江苏省医学物理工程研究中心,江苏 常州 213003)

骨对人体起着至关重要的承重作用。骨缺损是一种常见疾病,对人体健康构成了极大的威胁。引导骨再生(GBR)作为一种旨在通过使用屏障膜实现骨再生的治疗方式在1988年被引入。随着时间的推移,GBR已经是一项成熟的骨愈合技术。GBR技术使用膜作为物理屏障,在骨缺损部位形成一个封闭空间,防止纤维结缔组织入侵骨缺损区域,从而促进缺损部位骨组织再生[1]。而使用的膜需要满足一些要求:1)膜的化学性质稳定,屏障膜的化学性质必须在所含聚合物之间的化学键中具有稳定的化学结构;2)膜表面的完整性,阻止骨缺损空间被入侵;3)有一定的机械强度,膜必须具有良好的力学性能,即抗拉强度能够提供足够的弹性、柔韧性和强度特性,以保持结构完整性和承受组织和骨骼的抗拉强度;4)良好的生物相容性和生物降解性,防止复合膜本身刺激骨缺损部位;5)膜与周围骨组织之间适当的黏附性,以防止膜的移动。这些需求能够支持最佳的骨组织再生[2-3]。然而大多数复合膜缺乏机械稳定性,具有复杂的机械载荷,导致复合膜变形、移位和松动,难以保护新骨再生和重塑。

羟基磷灰石(HA)作为一种理想的人工骨材料,具有生物相容性良好、易被人体吸收及有利于成骨细胞黏附生长等特点,已被广泛用于骨缺损修复中[4]。由于HA本身的力学性能差、脆性大、附着力差等缺点,很少单独使用。但是,HA具有疏松的多孔结构和较高的结晶度[5],并且HA与各种材料具有不错的相容性,可以均匀地分布到材料中去,表现出潜在的生物学优势。HA和改性的HA常常与各种材料复合或者交联,通过将聚合物材料与羟基磷灰石颗粒结合在GBR中,可以定制复合膜的物理、机械和生物特性,HA本身的缺点也通过材料的结合得到改善,能够更好地发挥HA性能。目前,HA与天然高分子材料、人工材料、金属材料复合,获得的复合膜具有优异的GBR性能。本文就含有HA的各种复合膜展开讨论。

1 HA与天然高分子材料复合

胶原蛋白是一种天然提取物,呈纤维状结构,在人体中含量丰富,它具有生物可降解、生物相容性好以及无细胞毒性等优点,但是作为膜材料存在着机械强度差、降解速度快以及成本高等缺点[6]。Sun等[7]研究了双分子层纳米羟基磷灰石/矿化胶原复合膜对狗的牙槽嵴保存的影响,该复合膜由致密层和疏松层组成,致密层主要成分为羟基磷灰石和Ⅰ型胶原蛋白,疏松层为Ⅰ型胶原蛋白。复合膜的三维网状结构为细胞的增殖提供了理想的微环境,并作为细胞生长的底物,为成骨细胞提供黏附、分化和增殖的场所。通过对狗的牙槽嵴实验,羟基磷灰石和Ⅰ型胶原蛋白的质量比例为3∶7和5∶5的骨再生效果更好。虽然牙槽窝解剖结构的差异和狗舔舐伤口的习惯可能会导致实验数据的偏差,但总体结论表明,由羟基磷灰石和Ⅰ型胶原蛋白组成的复合膜具有较大的表面积,能够屏蔽不良细胞侵入植入区,促进骨细胞附着、增殖、刺激细胞分化。

壳聚糖(CS)是一种由甲壳素通过脱乙酰得到的天然生物聚合物,是由n-乙酰氨基葡萄糖和n-葡萄糖胺以1-4糖苷键连接而成的多杂糖。壳聚糖具有良好的生物相容性、生物安全性、生物降解性以及机械强度比胶原高,还具有化学惰性、抗氧化、抗菌和抗肿瘤等特性[8]。但生物活性较低,脆性较高,导致难以应用于手术。壳聚糖对肉芽组织的形成有促进作用。壳聚糖可以通过级联反应活化成骨细胞。然而,壳聚糖的力学性能较差,不足以单独用作骨再生的空间维持及引导作用。Tu等[9]采用溶液共混和真空蒸发法制备了不对称纳米羟基磷灰石/壳聚糖(n-HA/CS)复合膜。该不对称复合膜由致密层和疏松层组成,致密层防止纤维结缔组织入侵骨缺损空间,疏松层直接接触骨缺损空间,因其结构粗糙,与宿主组织结合较好,成纤维细胞数量明显减少,有利于新形成骨组织的长入。纳米羟基磷灰石的加入,改善了壳聚糖膜的力学性能,即膜的拉伸强度和断裂伸长率在潮湿条件下均高于纯壳聚糖膜。制备的n-HA/CS非对称膜在8星期前结构完整,在植入12星期时发生明显降解,表明该非对称膜可满足临床对GBR膜的要求。然而壳聚糖通过刺激炎症细胞促进伤口愈合,在体内具有抑制细菌生长的作用,从而导致炎症反应过表达。甲壳素是乙酰化的壳聚糖,可以用于替代壳聚糖,减少炎症表达[10]。

Teng等[11]设计了一种含有胶原、羟基磷灰石和壳聚糖三层结构的复合膜,该复合膜上下两层为羟基磷灰石和胶原蛋白,中间层为壳聚糖,通过逐层过滤工艺配制成结构紧凑的整体膜。该复合膜表面呈现出完整的多孔结构,新骨通过微孔生长到膜内,膜与新生骨紧密结合,黏附性增加。壳聚糖层提升了膜的高拉伸强度和弹性模量,而胶原/HA复合层的存在使其具有良好的柔韧性和生物活性。

Jiang等[12]采用逐步静电组装的方法制备了壳聚糖/纤维素/纳米羟基磷灰石(CS/CMC/n-HA)复合膜,CMC与CS的结合提高了CS膜的降解速度,而n-HA的加入可以减缓CS/CMC膜的降解,促进细胞黏附扩散和增殖分化。实验还表明n-HA质量分数增加到60%时,复合膜不能保持长期稳定,后期降解加速。杂交膜中的n-HA能够促进细胞的黏附、扩散、增殖和分化,高比例的n-HA可以提升膜的细胞相容性。该复合膜用于仿生螺旋-圆柱支架,因其表面结构多孔,骨会在整个支架空间形成,并可以观察到富含间充质干细胞和成骨细胞的骨髓。这种不连续的骨生长方式愈合速度更快。

2 HA与人工材料复合

聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)是由聚乳酸(PLA)和聚乙醇酸(PGA)共聚而成,PLA、PGA、PLGA因其可生物降解性、生物相容性、高力学性能以及优异的成型和成型性能而得到广泛应用[13]。PLA膜由于水解后的产物是二氧化碳和水,对人体相对安全,因此常作为一种疏水材料[14]。Han等[15]研究制备了HA/PLA复合膜。复合膜的PLA侧具有疏水性光滑的表面,使复合膜具有阻隔功能。而HA侧具有亲水性,表面粗糙,有利于干细胞或前体细胞的附着、增殖和分化。通过将PLA浇铸在HA纳米线上而成,制备的复合膜具有阻隔和成骨诱导功能。

PLGA的降解速率可以通过改变乳酸与乙醇酸的比例来调节,这对于开发拥有不同降解特性的膜非常有用。此外,PLGA的降解产物可以通过生物的自然过程代谢掉,但患者的生理环境可能会因为PLGA的降解而变酸,导致骨修复部位产生局部炎症。聚合物与细胞之间的相容性差也会导致体内排异反应,并且它们不容易被生物活性部分修饰[16]。Fu等[17]首次采用相反转和静电纺丝相结合的方法,制备出具有不同结构和表面的新型PLGA/n-HA功能梯度双层膜。先用相反转法制备含有PLGA和n-HA的致密层,然后用静电纺丝法制备了多孔纳米纤维层。有趣的是,n-HA的加入并没有使得力学性能降低,掺入30%含量的n-HA复合膜表现出3.18 MPa的抗拉强度,与市售的猪胶原加工纯化制成的双层可吸收胶原膜抗拉强度相当。在膜降解的过程中也能够很好地防止成纤维细胞渗透进膜封闭区,表现出良好的多孔纳米纤维结构。该相转化膜在降解后仍能保持30 d的完整性。Dos等[18]也是用同样的方法制备了聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石/β-磷酸三钙(PLGA/HAp/β-TCP)双分子层膜。其中致密层PLGA和HA的质量分数比例为95∶5,具有良好的孔径[(4.20±2.55) μm]和不对称的孔隙结构,这表明该膜致密层具有很好的阻止成纤维细胞侵入的能力。电纺层则制备了不同质量分数比例的HA和β-TCP,其中70∶30组的存储模量最好,60∶40组的成骨细胞反应最好,加入的β-TCP可以改善成骨细胞的附着和迁移,而小粒径磷酸钙的高比表面积有助于磷酸钙和静电纺纤维的黏附。电纺层的孔隙率约为38.2%,表现出养分渗透和成骨细胞迁移的潜力。两层复合后获得的膜刚度和弹性达到了不错的平衡状态。体外降解评价表明,获得的膜在60 d后质量损失<10%,这可能是磷酸钙的高质量分数(30%)造成的,据报道HAp和β-TCP即使在体内2.5年后也不会完全降解,复合膜缓慢降解这一功能与骨再生需要较长的时间不谋而合。这些都表明复合膜具有足够的机械性能,以防止膜在使用中坍塌。

Torres等[19]则将PLGA膜使用氧等离子体(PO2)修饰,然后在膜上添加一层超薄的纳米结构羟基磷灰石,形成PLGA/PO2/HA复合膜。经过氧等离子体处理,聚合物的粗糙度得到提升,在膜表面引入化学功能,刺激了成骨介质和细胞的黏附,加速了膜降解。而HA具有较高的亲水性可以中和PLGA的酸性降解产物,改善了膜降解后的酸性环境,并且复合膜还表现出优秀的钙收集能力和骨样磷灰石形成能力,具有良好的骨导电性。实验表明,和对照膜相比,与复合膜结合的成骨细胞数量更多、体积更大,并且活细胞结合率均高于对照膜,故PLGA/PO2/HA膜显示出良好的骨缺损再生潜力。Huang等[20]采用聚乙烯亚胺(PEI)在聚乳酸-羟基乙酸酯/纳米羟基磷灰石(PLGA/n-HA)表面形成活性基团,并在活性基团上接枝精氨酸-gly-asp (RGD),得到了新型PLGA/n-HA二维膜,表面改性后PLGA/n-HA的亲水性显著提高。实验表明,表面改性后PLGA/n-HA膜的亲水性显著提高,促进了骨髓间充质干细胞在复合膜表面的增殖和分化,对兔下颌骨缺损的骨再生具有良好的效果。

聚L-乳酸(PLLA)与PLGA同样是一种合成的可生物降解聚合物,也用作生物可降解医用膜的材料,它不会引发动物源性生物材料所具有的感染和免疫反应,因此PLLA作为生物医学材料在骨愈合材料、组织工程和药物输送领域得到了广泛的研究[21]。Ikumi等[22]利用未烧结的羟基磷灰石(u-HA)经过水化处理与PLLA复合。复合后的u-HA/PLLA膜表现出网状结构,弹性接近天然皮质骨。通过紫外线照射还可以增加亲水性,并显著提高该复合膜的生物相容性。实验中,使用u-HA/PLLA膜后,大鼠骨缺损边缘形成板层状骨,表明成骨细胞有规律地形成新骨,并为骨再生提供足够的生长空间。然而u-HA/PLLA膜降解时间较长,据报道,与u-HA/ PLLA膜相同材料的骨固定膜在术后需要3～5年才能完全吸收。不足之处在于没有评估膜降解过程如何影响新形成的骨和周围组织。

聚多巴胺(PDA)具有良好的黏附能力和生物相容性,它含有儿茶酚和氨基,可应用于各种材料的表面改性,是生物医学表面改性的重要候选材料。此外,PDA薄膜可以作为生长因子仓库提供多个反应位点。然而,PDA纳米膜缺乏成骨诱导性,限制了其在骨组织工程中的应用[23]。Xie等[24]使用脉冲电化学驱动逐层组装工艺制备了含聚多巴胺和羟基磷灰石的多层纳米复合膜,该复合膜具有较高的骨形态发生蛋白负载率,可以实现骨形态发生蛋白的持续递送,体外骨髓间充质干细胞培养和大鼠体内植入实验表明,多层纳米膜具有较高的成骨诱导能力。

聚己内酯(PCL)以二元醇为引发剂,由己内酯开环聚合而得到的热塑性结晶聚酯,具有可生物降解、降解速度慢、机械强度强等特点。目前,PCL已被食品和药物管理局批准为用于人体的医疗和药物输送设备[25]。Tsai等[26]采用溶胶-凝胶法制备了锶取代羟基磷灰石纳米纤维,然后将锶取代羟基磷灰石纳米纤维碎片加入PCL中,制备了引导骨再生的有机-无机复合膜。锶取代羟基磷灰石不仅能促进间充质干细胞的活性,还能抑制间充质干细胞的脂肪生成,同时锶取代羟基磷灰石质量分数为19.5%的膜的细胞附着水平最高。该复合膜可以促进成骨样细胞的分化和矿化,具有应用于GBR的潜力。

聚乙烯醇(PVA)是由醋酸乙烯聚合、醇解而成,具有良好的生物相容性、无毒性、亲水性和化学稳定性。聚乙烯醇的表面具有摩擦和抗张力,且分子之间有高黏着性,形成的薄膜无色透明,机械强度高,表面光洁,而且可降解[27]。Zeng等[28]采用溶剂铸造和蒸发法制备了纳米羟基磷灰石/聚乙烯醇(n-HA/PVA)复合膜。在n-HA质量分数不超过20%时,n-HA和PVA均匀分布。n-HA的掺入使得PVA基体亲水性显著降低,虽然降低了复合膜的拉伸强度和延展率,但复合膜的杨氏模量得到提高,当复合膜含有质量分数40%的n-HA时,杨氏模量最佳为(567.5±40.2) MPa。将n-HA掺入PVA基体中,n-HA的脆性得到优化。研究表明n-HA/PVA复合膜具有良好的生物相容性,膜的表面适合成骨细胞的黏附和增殖。

氧化石墨烯是石墨烯的氧化物,作为一种非传统型态的软性材料,氧化石墨烯具有胶体、聚合物和两性分子的特性,它比石墨烯含有更多的含氧官能团,从而理化性质较石墨烯更加活泼。氧化石墨烯有着独特的机械和光学性质,可以在生物医学工程、组织过程、医学影像等领域都发挥着巨大的作用。还原氧化石墨烯通过化学或物理方法产生,去除了部分含氧官能团,提高了化学稳定性和力学性能。但石墨烯或氧化石墨烯在体内应用可能会产生细胞毒性和遗传毒性,氧化石墨烯自身的生物安全问题限制了其在医学临床上的应用[29]。Liu等[30]采用两步电化学方法制备了三维多孔还原氧化石墨烯/羟基磷灰石(3D rGO/HA)复合膜。电化学还原制备的3D rGO/HA复合膜不仅具有可用的塑性,而且还能保持弯曲的形状,该复合膜一侧为三维多孔还原氧化石墨烯和沉积的HA,3D rGO/HA复合膜面向骨组织的多孔侧可促进成骨细胞的增殖和成骨分化,另一侧为致密的二维还原氧化石墨烯表面,而面向软组织的致密侧具有良好的生物相容性,有望促进软组织的生长。此外,3D rGO/HA复合膜可在颅骨缺损模型中指导大量高矿质密度新骨的再生。研究发现3D rGO/HA复合膜对不同细胞具有良好的生物相容性,在体内外均具有增强的成骨活性。

3 HA与人工材料和天然材料复合

单组分材料在提供结构支撑和促进骨再生方面已经逐渐不如多组分材料,由HA与人工材料和天然材料组成的复合膜,能够满足良好的物理、化学和生物等需求。Bhuiyan等[31]将羟基磷灰石与PLGA和胶原复合,羟基磷灰石纳米颗粒分布均匀,胶原蛋白在PLGA主链上,复合后的膜在弯曲方面更有弹性。羟基磷灰石-PLGA-胶原膜的极限抗拉强度为(4.1±1.4) MPa,非常接近人松质骨7～20 MPa。羟基磷灰石-PLGA-胶原膜的弯曲模量[(0.09±0.03) GPa]在人松质骨(0.05～5 GPa)的范围内。骨髓间充质干细胞在第五星期时,会在复合膜上分泌基质和矿物质,可以减轻PLGA水解而造成的机械强度损失。改变生物材料中羟基磷灰石、胶原蛋白、PLA和PGA的比例,可以改变羟基磷灰石-PLGA-胶原膜的机械强度、降解率和热稳定性,这可以扩大羟基磷灰石-PLGA-胶原复合膜的长期储存能力和植入的适用性。Jin等[32]通过静电纺丝制备含鱼胶原蛋白(FC)和羟基磷灰石增强的PLGA纤维膜,FC和HA颗粒均匀分布在PLGA纤维基质中。FC与PLGA相互作用形成的增强型聚合物链网络显著提高了PLGA膜的抗拉强度,并加快了PLGA膜的降解速度。而纳米羟基磷灰石提高了PLGA膜与骨髓间充质干细胞的细胞相容性,改善了复合膜的成骨活性。

Niu等[33]结合溶剂铸造和静电纺丝技术设计了一种双层组织导向复合膜,一层由聚酰胺-6/壳聚糖构成,另一层由聚酰胺-6/羟基磷灰石构成,该复合膜与天然骨组织结构相似,两层通过分子相互作用和化学键结合,形成紧密无缝的层状结构。Tamburaci等[34]采用冷冻干燥和静电纺丝技术制备了一种新型双层纳米复合膜,其微孔层由壳聚糖和掺硅纳米羟基磷灰石颗粒通过冷冻干燥技术制备,所得多孔层孔隙率为81%～85%,平均孔径为177～191 μm,适合细胞增殖。纳米纤维层由壳聚糖/聚环氧乙烷(PEO)纳米纤维通过静电纺丝技术制备,获得的纳米纤维层具有平均纤维直径为107 nm,具有阻止成纤维细胞迁移到骨缺陷部位的屏障性能。复合后形成了具有不同形态的两层一体化纳米复合膜。掺硅纳米羟基磷灰石颗粒的加入提高了复合膜的力学和物理性能,壳聚糖层的压缩模量为81.4 kPa,当掺硅纳米羟基磷灰石颗粒掺入量为50%,最大应变为90%时,复合膜的压缩模量增加到212.5 kPa。并控制了复合膜的生物降解性,通过增强人成骨肉瘤细胞在复合膜表面的附着、扩散和生物矿化能力来诱导人成骨肉瘤细胞的生物活性。

Ariesanti等[35]研究了PVA -胶原蛋白- HA复合膜在不同剂量的辐照下,化学结构、抗拉强度、孔隙率和可降解性的变化。拉伸强度随着γ辐照剂量的增加而显著增加,抗拉强度的增加是由于交联反应的增加,交联反应可以降低聚合物膜的结晶度,从而使抗拉强度值变高[36-37]。并且医用生物材料的最佳灭菌剂量为25 kGy[38]。说明25 kGy辐照组的PVA -胶原蛋白- HA复合膜具有最佳的抗拉强度和最佳的杀菌剂量。辐射剂量越大,孔隙尺寸也会变大。其中PVA -胶原蛋白- HA复合膜25 kGy辐照组化学结构稳定,抗拉强度最高,孔隙尺寸理想,降解率最低,符合GBR膜的要求。

Liu等[39]首次采用一步真空过滤和仿生矿化法制备了同时含有壳聚糖和羟基磷灰石的氧化石墨烯基(GO/CS/HA)复合膜。CS和HAP提高了复合膜的机械强度和表面亲水性,GO/CS膜的平均抗拉强度为(44.79±2.13) MPa,经过HA沉积后,GO/CS/HA复合膜的抗拉强度增加了20 MPa。在GO/CS/HAP复合膜上,成骨细胞的分化表现出较高的碱性磷酸酶活性、矿化和相关基因表达。在大鼠颅骨缺损模型上使用复合膜,表现出不错的成骨能力。GO/CS/HAP复合膜具有独特的仿生多孔结构、优越的力学性能和优异的骨再生能力,是应用于GBR的潜在材料。Souza等[40]将壳聚糖-黄原胶配合物与不同浓度的羟基磷灰石-氧化石墨烯(HA-GO)纳米复合材料相关联,得出的结论为,虽然HA-GO的加入降低了膜的机械强度,但提高了膜的生物相容性,细胞在复合膜上的活力更高。

4 HA与金属材料复合

不少研究发现,镁、锌等金属元素对骨再生有良好的促进作用。镁可以诱导新骨的形成并促进骨组织愈合,而且镁可以在人体内被消耗降解,表现出良好的生物相容性。然而,镁在人体内环境很容易被腐蚀,然后失去原来的功能。此外,镁与生物环境作用产生的副产物对邻近组织有害,产生的氢气和氢氧根离子会引起碱性中毒、造成炎症刺激和组织坏死,这极大地限制了镁的应用[41]。而胶原膜等可吸收非金属膜保留力和机械强度低,操作难度大。Byun[42]研制了一种可吸收金属网(羟基磷灰石包覆镁网),具有可接受的机械性能和满足生物相容性的能力,该复合膜可在体内缓慢降解,并且在骨再生过程中提供了不错的支撑能力。

适量的锌可以促进骨的形成和矿化,锌的缺乏会导致骨骼矿化不良、骨骼生长迟缓以及骨结构形态异常。锌通常以合金的形式应用于骨再生领域,具有较好的抗菌和成骨能力[43]。但锌的本身生物相容性较差,且高比例的锌含量可能会引起不良副作用,研究表明,含有5%的锌是诱导骨再生的最佳浓度。Chou等[44]将羟基磷灰石与锌粉进行热处理掺入到明胶中,交联生成复合膜,该膜在酸性条件下释放锌离子,在大鼠颅骨缺损模型中,成骨主要发生在复合膜表面,这可能是因为复合膜的表面钙离子浓度较高,导致新生成的骨生长到膜中。锌的最佳浓度是多少仍需要进一步实验。

5 总结

含有羟基磷灰石的复合膜用于骨再生研究已逐渐增多,它不仅可以提供骨再生需要的密闭环境,而且具有促进和引导骨再生的作用。羟基磷灰石与各种材料相结合,提高了复合膜的生物相容性,改善了复合膜的力学性能,增强了复合膜引导骨再生的能力,特别对于复合膜降解率的可控性提供了不错的选择,在医用领域降低了复合膜的使用难度。尽管目前含羟基磷灰石复合膜有着不错的性能,但还是存在着些许问题,对于骨重建的效果也还是有限的,并且可能会造成不良反应。期待未来的研究能够运用更多的技术手段来改良复合膜的骨再生能力,以及有更多的新型材料用于GBR复合膜。