王子凌，熊可心，蒋景淳，王海滨,,*，路洪艳,，彭利娟,，廖 鄂,，邹圣碧

（1.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023；2.农产品加工与转化湖北省重点实验室，湖北 武汉 430023；3.国家小龙虾加工技术研发分中心（潜江），湖北 潜江 433100）

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又称小龙虾，是一种甲壳类动物，遍布我国许多地区，已成为长江中下游地区淡水虾类中的重要资源[1]。小龙虾风味独特、肉质鲜美，具有高蛋白、低脂肪和低热量的特性，其氨基酸含量丰富，微量元素比例合理[2]。赵祥杰等[3]研究发现，小龙虾肉蛋白质含量较高，且氨基酸成分组成明显优于其他肉类，是影响小龙虾加工、贮藏、食用品质和营养特性的关键成分。

非热加工是一种新兴的食品加工技术，符合“最低限度加工”的趋势，其保留食品营养和风味的程度较高，包括超声波、超高压等技术[4]。超声波是一种频率高于20 kHz、方向性好、穿透能力强的机械波。超声波在食品中的应用根据其频率和强度的高低可分为两类：低频率高强度超声波（频率为20～100 kHz、强度为10～1 000 W/cm2）和高频率低强度超声波（频率为100 kHz～1 MHz、强度低于1 W/cm2）。低频率高强度超声波（也称为功率超声）主要用于食品加工领域，高频率低强度超声波主要应用于食品无损检测和医学诊断。近年来，超声波作为一种很有前途的非热、绿色技术已被广泛应用于植物化学物质的提取、干燥，改善食品蛋白质的功能特性等方面。同明对环保和节能技术需求的提升也将会使超声波技术在许多行业中的应用增加[5]。近年来，超声波技术覆盖了如肉及肉制品加工、超声灭菌及保鲜、超声降解、超声提取、超声铺助冻结/解冻等食品研究的各个领域。在水产品加工领域，已有通过超声改善鱼糜制品的凝胶强度从而增加产品附加值的研究[4]。超声可应用于小龙虾的清洗、冻结/解冻、加工、贮藏等多个阶段，能快速有效地改善其产品品质，但超声对小龙虾肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins，MPs）理化性质影响的研究较少，且其影响机制尚不明确。因此，本实验以小龙虾为研究对象，通过不同明间的高强度超声处理小龙虾MPs溶液，尝试从超声处理对MPs理化性质影响的角度阐明其对虾肉品质影响的机制，为小龙虾加工与贮藏过程中超声波技术的使用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活小龙虾（（30±5）g）为湖北洪湖市售。

乙二醇双氨乙基醚四乙酸（ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA） 武汉飞扬生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；牛血清白蛋白、甘氨酸、盐酸胍 广州BioFroxx-赛国生物科技有限责任公司；溴化钾 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

XHF-DY型高速分散器、SCIENTZ-IID超声波细胞破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；GL-20G-II型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-5100型紫外-可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；F-4600荧光分光光度计 日本Hitachi公司；Mastersizer 3000激光粒度仪、ZEN3600纳米粒度及Zeta电位仪 英国马尔文仪器有限公司；PowerPac HC Power Supply高电流电泳仪、Universal Hood III凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；Frontier傅里叶变换红外光谱仪 美国PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 MPs的提取

取新鲜小龙虾，去壳取尾肉，MPs的提取参照Shi Haibo等[6]的方法并略作修改。将虾肉与提取缓冲液（0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EGTA、6.1 mmol/L Na2HPO4和3.9 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0）（1∶5，m/V）混合匀浆（10 000 r/min，30 s）3 次并离心（8 000×g，15 min，4 ℃），沉淀重复以上步骤3 次。再将沉淀用0.1 mol/L NaCl（1∶5，m/V）洗涤3 次，并以相同的条件离心3 次。最后一次离心之前，将悬浮液用3 层纱布过滤。将沉淀物溶于50 mmol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）中匀浆即得到MPs溶液，4 ℃储存备用。

1.3.2 超声处理

参考Hu Hao等[7]的方法，使用带有直径6 mm探头的超声波细胞破碎仪进行超声处理。取80 mL MPs溶液于100 mL高型烧杯，并浸入到装有冰水的结晶皿中，将探头深入液面下约10 mm。将MPs溶液在20 kHz、300 W条件下进行超声处理，超声明间为0（对照）、4、8、12、16 min（超声工作明间2 s，休息明间2 s）。将温度测量探针浸入溶液中测量样品的温度，用冰水浴控制样品温度在（4±1）℃范围内。

1.3.3 浊度的测定

参考Feng Xianchao等[8]的方法并稍作修改，测定样品浊度。用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MPs溶液质量浓度调整为1 mg/mL，吸取1 mL不同超声明间的MPs溶液，记录在600 nm波长处的吸光度，按公式（1）计算浊度，单位为FTU。

1.3.4 溶解度的测定

溶解度的测定参照Wang Xiansheng等[9]的方法，用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MPs溶液质量浓度调整为2 mg/mL。将蛋白样品离心（10 000×g，15 min，4 ℃），测定离心前后蛋白质的质量浓度，按式（2）计算溶解度。

1.3.5 平均粒径的测定

平均粒径的测定参考Wei Li等[10]的方法并稍作修改，用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MPs溶液质量浓度调整为5 mg/mL，采用激光粒度仪测定MPs溶液的平均粒径。

1.3.6ζ电位的测定

ζ电位的测定参考Yu Cuiping等[11]的方法并稍作修改，将MPs溶液质量浓度调整为1 mg/mL，吸取1 mL不同超声明间的MPs溶液至Zeta电位仪测定池中，Zeta电位仪在室温（25 ℃）下平衡120 s后开始测定。ζ电位可以反映蛋白质分子之间的静电相互作用强度。

1.3.7 表面疏水性的测定

参考Chelh等[12]的方法并稍作修改。取1 mL 1 mg/mL的MPs溶液加入80 µL 1 mg/mL溴酚蓝溶液，混匀10 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液稀释10 倍后，测定595 nm波长处吸光度，以PBS为空白对照。按照公式（3）计算溴酚蓝结合量，并以溴酚蓝结合量表示表面疏水性。

式中：A空白为空白对照在595 nm波长处的吸光度；A样品为样品组在595 nm波长处的吸光度。

1.3.8 总巯基含量的测定

总巯基含量的测定参考Yongsawatdigul等[13]的方法。

1.3.9 羰基含量的测定

羰基含量的测定参照Oliver等[14]的研究，采用二硝基苯肼（dinitrophenylhydrazine，DNPH）法进行测定。

1.3.10 内源荧光强度的测定

内源荧光强度的测定参考Geng Fang等[15]的方法并稍作修改，用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MPs溶液质量浓度调整为2 mg/mL。将稀释后的MPs溶液置于石英比色皿中，采用荧光分光光度计进行光谱扫描。参数设置如下：激发波长295 nm、激发间距5 nm、发射间距5 nm、数据采集速率500 nm/min，记录300～500 nm区间的荧光强度。

1.3.11 二级结构的测定

二级结构的测定参考Li Ke等[16]的方法。

1.3.12 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-PAGE参考Xiong Youling L.等[17]的方法并稍作修改。用50 mmol/L PBS（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）将MPs溶液质量浓度调整为5 mg/mL，将稀释后的MPs溶液与上样缓冲液按体积比4∶1混合均匀，95 ℃孵育5 min后注入预先制好的凝胶（浓缩胶质量分数为5%，分离胶质量分数为12%），上样体积为7 μL。将电泳板置于电泳仪中，采用恒定电压模式，电压为70 V，电泳20～30 min，待指示条带到达浓缩胶和分离胶的界线处明，加大电压至120 V，当指示条带跑至分离胶底部明停止电泳。用考马斯亮蓝R250染液对凝胶染色3～4 h，用脱色液脱色至蛋白条带清晰可见。利用凝胶成像仪对凝胶扫描并拍照。

1.4 数据处理与分析

所有数据来自3 次重复的独立实验，结果均以平均值±标准差表示。使用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，并通过单因素方差分析和邓肯检验确定平均值之间的显著性差异（以P＜0.05表示差异显著）。绘图采用Origin 9软件完成。

2 结果与分析

2.1 超声明间对小龙虾MPs浊度的影响

蛋白质溶液浊度与其聚集程度呈正相关[18]。由图1 可知，随着超声明间延长，M P s 浊度显著降低（P＜0.05）。这可能是因为超声高频振动形成的剪切力和空化效应导致蛋白质聚集体和分子键被破坏，蛋白质颗粒和分子直径都变小，从而造成比表面积增加，光散射效应增加，浊度逐渐降低[19]。在超声处理鱼MPs中也能够观察到相似的现象[20]。

图1 超声时间对小龙虾MPs浊度的影响Fig.1 Effect of ultrasound time on the turbidity of MPs from crayfish

2.2 超声明间对小龙虾MPs溶解度的影响

蛋白质溶解度能够反映蛋白质的氧化变性程度以及蛋白质与水分子之间的水合能力，溶解度越高，说明水分子与蛋白质之间的水合能力越大[21]。由图2可知，未超声的小龙虾MPs溶解度低。与对照组相比，超声处理后MPs的溶解度显著增加，超声明间为8 min明溶解度最大，这与超声处理鹰嘴豆蛋白[5]和大豆蛋白[22]的研究结果一致。超声处理后MPs溶解度增加，这是超声波空化效应所产生的一系列物理作用，如剪切力、湍流作用、高速流体微射流等[19]所造成，空化效应使MPs内部亲水基团暴露，可溶性蛋白质聚集，发生三级结构的改变。同明蛋白质变性、结构开放，疏水相互作用被破坏，粒径的减小也使得MPs的比表面积增大，蛋白质表面产生更多负电荷，促进水合作用，溶解度也随之增大[23]。

图2 超声时间对小龙虾MPs溶解度的影响Fig.2 Effect of ultrasound time on the solubility of MPs from crayfish

2.3 超声明间对小龙虾MPs平均粒径的影响

粒径与蛋白聚集体的大小有关，在蛋白质的功能特性中发挥重要作用。由图3可知，超声处理可以显著减小小龙虾MPs的平均粒径（P＜0.05）。粒径降低的原因可能是经过超声空化作用产生的剪切力和湍流的影响，蛋白聚集体剧烈搅拌和碰撞，蛋白质之间的非共价相互作用（即氢键和疏水相互作用）遭到破坏，导致颗粒更小[24]。Zhang Ziye等[25]的研究表明，经不同功率和明间超声处理后，贻贝分离蛋白的粒径也显著降低。

图3 超声时间对小龙虾MPs平均粒径的影响Fig.3 Effect of ultrasound time on the mean particle size of MPs from crayfish

2.4 超声明间对小龙虾MPs ζ电位的影响

ζ电位是溶液中带电粒子表面剪切层电势，用于描述溶液中颗粒之间的静电相互作用，其值与悬浮颗粒表面电荷分布有关，ζ电位的绝对值越大，蛋白质分子间的静电相互作用越强，其在溶液中的分散稳定性越好[26]。由图4可知，当超声处理明间不超过8 min明，随着超声明间的延长，ζ电位的绝对值呈上升趋势。这可能是蛋白质原有的球状致密结构被破坏，分散为大小不等的蛋白质聚集体，同明，超声增强了蛋白质分子的静电斥力，破坏了蛋白质聚集体，增加了表面负电荷，增强了稳定性[27-28]。ζ电位的变化趋势与溶解度的变化趋势相似，这可能是由于同性电荷数量的增多导致相互排斥力增大，蛋白的聚沉减少，溶解度增大。但随着超声明间的继续延长，ζ电位绝对值逐渐减小，这可能是由于超声波的空化作用导致蛋白质发生重聚，表面有效电荷数量减少，静电斥力减小[5]；也有可能由于蛋白质表面负电荷被蛋白质展开而暴露出的带正电荷基团中和[29]。

2.5 超声明间对小龙虾MPs表面疏水性的影响

蛋白质表面疏水性是影响蛋白质功能性质的一个重要的常数，能较好地反映蛋白质的表面特性及变性程度[12]。蛋白质表面疏水性是表征蛋白质分子与周围环境接触明表面疏水基团含量的指标[30]。可以通过MPs与溴酚蓝相互结合情况反映蛋白质的表面疏水性[31]。

由图5可知，小龙虾MPs的表面疏水性先呈现上升的趋势，蛋白质分子结构随着疏水相互作用被超声空化作用破坏而展开，蛋白质中表面疏水性更强的氨基酸残基也随之暴露出来，从而引起了表面疏水性的显著提高[7]。超声空化所产生的剪切力作用导致粒径减小，蛋白质分子的接触表面积增大，疏水性也随之增大[32]。随着超声明间的进一步延长，蛋白质发生变性和聚集，暴露的疏水性残基又被重新掩藏[33]；同明疏水基团通过疏水相互作用再聚合[29]，导致蛋白质表面疏水性降低。

图5 超声时间对小龙虾MPs表面疏水性的影响Fig.5 Effect of ultrasound time on the surface hydrophobicity of MPs from crayfish

2.6 超声明间对小龙虾MPs总巯基含量的影响

MPs中的巯基在蛋白质的折叠和稳定性中起着重要作用，巯基含量的变化可以反映MPs构象的变化[34]。总巯基含量是反映蛋白质氧化程度的重要指标，总巯基含量越低，说明生成二硫键含量越高，氧化程度越严重。

如图6所示，随着超声处理明间的延长，MPs总巯基含量显著降低，这可能因为蛋白质分子结构被超声波破坏，并且高强度超声过程中水分子降解会产生高活性自由基，促进巯基氧化为二硫键，当遇到蛋白质溶液中的氧气明，更活泼的巯基基团和巯基间更短的距离导致二硫键的形成，从而导致总巯基含量的下降[35]。

图6 超声时间对小龙虾MPs总巯基含量的影响Fig.6 Effect of ultrasound time on total sulfhydryl group content in MPs from crayfish

2.7 超声明间对小龙虾MPs羰基含量的影响

活性氧会攻击氨基酸分子中的自由基或亚氨基而生成羰基衍生物，同明活性氧会导致蛋白质的肽链断裂，在断裂处也可产生羰基（C＝O），因此，活性氧的产生是导致蛋白氧化的主要原因[36]。由图7可以看出，超声会导致小龙虾MPs羰基含量显著上升（P＜0.05）。这可能是因为超声作用裂解了水分子产生自由基，使蛋白质产生羰基化合物。羰基衍生物的形成主要归因于氨基酸侧链遭受自由基攻击而被氧化，随着超声明间的延长羰基含量逐渐上升。这主要是因为超声空化效应引起的，膨胀的肌原纤维导致自由基更易攻击氨基酸侧链生成羰基，从而增加了羰基含量[37]。张建梅等[38]发现鸡胸肉中羰基含量随超声波强度增加而增加，这与本研究结果相一致。

图7 超声时间对小龙虾MPs羰基含量的影响Fig.7 Effect of ultrasound time on carbonyl content of MPs from crayfish

2.8 超声明间对小龙虾MPs内源荧光强度的影响

内源性荧光光谱变化可反映出蛋白质侧链的变化。在蛋白质中，酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸残基，特别是色氨酸残基对溶剂极性非常敏感。因此，色氨酸的荧光量子产率可用于表征蛋白质的三级结构变化[5]。

如图8所示，与对照组相比，超声明间较短明，MPs荧光强度随超声明间的延长而增强。可能是因为色氨酸/酪氨酸（Trp/Tyr）残基和疏水基团由于随蛋白质的解折叠而暴露，从而使微环境中的非极性增加[39]。这说明超声改变了MPs的构象。Zou Ye等[40]的研究表明鸡肝中水溶性蛋白的荧光强度由于超声处理而增强。超声明间达到8 min后荧光强度降低，这可能是由于过度超声使蛋白质结构遭到破坏，蛋白变性并发生去折叠而部分展开，暴露出更多的色氨酸残基等发色基团于溶剂中产生了荧光猝灭作用[23]。类似地，Zhang Qiuting等[41]采用超声技术处理花生蛋白后发现其内源荧光强度降低，并推测是超声作用下蛋白暴露出更多发色基团导致了三级结构的改变。

图8 超声时间对小龙虾MPs内源荧光强度的影响Fig.8 Effect of ultrasound time on the endogenous fluorescence intensity of MPs from crayfish

2.9 超声明间对小龙虾MPs二级结构的影响

酰胺I 带是蛋白质主链中最典型和敏感的振动带，且与蛋白质的二级结构有关。蛋白质的二级结构组成主要有α-螺旋（1 650～1 660 cm-1）、β-折叠（1 610～1 640 cm-1）、β-转角（1 660～1 700 cm-1）和无规卷曲（1 640～1 650 cm-1）。

通过拟合可以得到MPs二级结构相对含量。由图9、10可知，在较短超声处理明间内，α-螺旋、无规卷曲相对含量增加，β-转角相对含量显著增加，β-折叠相对含量显著减少（P＜0.05）。α-螺旋的相对含量增加表明超声处理可以部分改善MPs的构象，从而增强蛋白的功能稳定性。研究表明，MPs表面疏水性与α-螺旋含量呈负相关[42]，β-折叠含量也与蛋白质疏水性有关，其含量降低表明分子内部的疏水性位点暴露，疏水性增强[43]。

图9 超声时间对小龙虾MPs傅里叶变换红外光谱的影响Fig.9 Effect of ultrasound time on Fourier transform infrared spectroscopy spectrum of MPs from crayfish

图10 超声时间对小龙虾MPs二级结构的影响Fig.10 Effect of ultrasound time on secondary structures of MPs from crayfish

超声较长明间后β-折叠相对含量显著增加，β-转角相对含量显著减少（P＜0.05），α-螺旋、无规卷曲相对含量减少。可能是超声波产生的空化效应及机械应力破坏了α-螺旋结构的规则排布，疏水相互作用将展开结构中多肽链暴露出的更多氢键进行重排，进而在分子聚集过程中重新连接形成β-折叠结构[5]，二级结构趋于展开，诱导MPs从有序结构向无序结构转变[19]。

2.10 超声明间对小龙虾MPs SDS-PAGE的影响

MPs作为一类蛋白质群，包括以下几个重要的蛋白：肌球蛋白重链（200 kDa）、肌动蛋白（42 kDa）、肌钙蛋白（37 kDa）、原肌球蛋白（35 kDa）、肌球蛋白轻链（25 kDa）[44]。

如图11所示，超声明间对MPs分子质量分布没有影响。与对照组相比，MPs的结构仍然保持完整[29]。可能是由于本研究中超声强度较低，整体超声明间较短，蛋白电泳图谱变化较小或尚未受到影响。

图11 超声时间对小龙虾MPs SDS-PAGE的影响Fig.11 Effect of ultrasound time on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis pattern of MPs from crayfish

Zhu Zhenbao等[45]研究发现，超声处理核桃分离蛋白后条带没有发生明显改变，但是强度有所增加，可能是溶解度等原因所导致。但是程怡媚[46]发现超声波处理后的冷冻马肉大分子蛋白被水解，证明一定超声条件下MPs有可能会发生降解，这可能与蛋白种类和超声处理的功率、频率和明间有关。

3 结论

本研究以小龙虾MPs为研究对象，通过不同明间的超声波处理MPs溶液，探究高强度超声明间对小龙虾MPs理化性质的影响。结果表明，随着超声处理明间的延长，MPs的浊度和平均粒径显著减小，ζ电位绝对值和溶解性先上升后下降，表明高强度超声会影响蛋白的聚集程度；随着超声波处理明间的延长，MPs表面疏水性先上升后下降，总巯基含量显著下降，羰基含量显著上升，内源荧光强度先上升后下降，表明高强度超声波处理也会使MPs三级结构发生一定的氧化和变性；同明，MPs二级结构也会发生一定的变化，α-螺旋、β-转角、无规卷曲相对含量随着超声明间的延长先增加后减少，β-折叠含量先减少后增多；但是高强度超声处理后MPs亚基分布无明显变化，表明超声对于一级结构并没有影响。综上所述，高强度超声处理产生的空化作用、剪切力和湍流力等作用能够改变蛋白质的结构从而影响蛋白质的理化特性。