罂粟科多刺绿绒蒿(Meconopsishorridula) 是一年或多年的草本绿绒蒿属植物。这种植物一般生长在海拔3 600～5 100 m的草坡上,产于我国的云南、四川、青海、甘肃和西藏等地,在尼泊尔、锡金、不丹也有分布[1-2]。《藏药志》中将绿绒蒿属植物记载为藏药“吾巴拉”,入药部位为全草或地上部分,性寒、味苦、有小毒,具有清热、止痛、活血化瘀等功效,可有效清除体内的过氧自由基,抑制细胞的退化、衰老及癌症的发生,还具有保护急性心肌缺血的作用,临床上主要以复方形式入药[3-4]。绿绒蒿属植物是野生高山花卉,具有“高山牡丹”的美誉,其化学成分主要包括挥发性成分、黄酮类化合物、生物碱等[5-7]。目前有研究表明可从该植物中检测到42种生物碱,其中包括碎叶紫堇碱、原鸦片碱、二氢血根碱、小檗碱等[8-11]。

研究显示糖尿病(diabetes mellitus,DM)、颅内动脉瘤(intracranial aneurysm,IA)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)和动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aneurysmal subarachnoid hemorrhage,aSAH)的发病均与氧化应激(oxidative stress,OS)密切相关[12-15]。在一般情况下,机体内的抗氧化作用与氧化作用处于一种平衡,然而由于某种因素导致机体内抗氧化与氧化作用失衡,倾向于氧化,即产生氧化应激[16]。有研究表明绿绒蒿中的总生物碱具有较强的抗氧化活性[17-19],故本研究采用高效液相色谱串联质谱联用技术(HPLC-MS/MS)对多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量进行测定,通过薄层生物自显影技术(TLC-Bio)判定其抗氧化活性,运用网络药理学筛选出碎叶紫堇碱干预氧化应激性疾病的潜在作用靶点和成分,分析潜在作用靶点参与的通路,解释碎叶紫堇碱辅助治疗以上4种氧化应激性疾病的作用机制。为多刺绿绒蒿中生物碱治疗氧化应激性疾病的基础药理学提供方向和参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 百万分之一电子天平(TOLEDOXR6TUD5,梅特勒托利多科技有限公司);万分之一电子天平(BSA224S,北京赛多利斯科学仪器有限公司);高效液相色谱-质谱联用仪(AB Sciex API4000,美国AB Sciex公司);超纯水机(UPR-II-20L,四川优普超纯科技有限公司)。

1.2 实验药材与试剂 碎叶紫堇碱(AF21020908,成都埃法生物科技有限公司,纯度98%);2,2-联苯基-1-苦肼基自由基(C10505863,上海麦克林生化科技有限公司);多刺绿绒蒿(由重庆市中药研究院刘翔副研究员鉴定基原);10 cm×20 cm薄层板(青岛邦凯高新技术材料有限公司);乙腈和甲醇(色谱纯,美国TEDIA公司);其余实验所用试剂均为国产分析纯。

1.3 多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量测定

1.3.1 仪器条件 色谱柱为ACE Excel 3 Super C18柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);进样体积为2 μL;流动相为A相,0.2%甲酸溶液,B相,乙腈;流速为0.25 mL/min;梯度洗脱为0～0.5 min,0%～5% B; 0.5～3.5 min,5%～95% B; 3.5～5 min,95% B;5～5.5 min,95%～5% B;5.5～8 min,5%～0% B。

采用电喷雾离子源(ES),在正离子模式下扫描,离子源温度(TENP)为600 ℃; 正离子模式下喷雾电压(IS)为5 500 V;气帘气压力(CUR)为15 psi;雾化气压力(GS1)为40 psi;辅助气压力(GS2)为55 psi。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取碎叶紫堇碱对照品适量,加甲醇配成质量浓度为0.587 mg/mL的对照品溶液。将碎叶紫堇碱对照品溶液用甲醇逐级稀释成由0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 μg/mL组成的标准工作液。

1.3.3 供试品溶液的制备 取本品粉末0.2 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25 mL,称定重量,回流处理1 h,放冷,滤过,称定重量,减少的重量用甲醇补足,过0.22 μm的微孔滤膜,作为供试品溶液。

1.4 利用薄层生物自显影对多刺绿绒蒿中的抗氧化活性成分进行分析

1.4.1 制备碎叶紫堇碱对照品溶液 精密称取适量的碎叶紫堇碱对照品,以甲醇为溶剂,配制成质量浓度为58.7 μg/mL和5.87 μg/mL的溶液。

1.4.2 TLC-Bio的薄层条件 按照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)试验,梯度吸取“1.3.2”项下制备的对照品溶液,分别点样于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-丙酮(6∶4)为展开剂,展开,取出,晾干,日光下检视;喷以0.1%的2,2-联苯基-1-苦肼基自由基乙醇溶液,晾干,37 ℃孵化20 min,置于日光下检视。

1.5 网络药理学

1.5.1 碎叶紫堇碱成分靶标收集 首先通过PubChem数据库查找碎叶紫堇碱的SMILES,然后通过使用Swiss Target Prediction数据库(设定Probability*≥0.1为筛选条件)和Super-PRED数据库(设定Probability≥50%为筛选条件)获取碎叶紫堇碱的靶点。

1.5.2 疾病靶标收集 分别以“aneurysmal subarachnoid hemorrhage、intracranial aneurysm、chronic obstructive pulmonary disease、diabetes mellitus”作为关键词,按照相关性得分(EI_gda=1)作为条件,利用DisGeNET数据库对疾病的相关靶标进行搜索并筛选;以相关性得分(Relevance score≥5)为条件,利用GeneCards数据库对疾病的靶标进行搜索并筛选,最后将两个数据库的结果取并集。

1.5.3 构建PPI网络及筛选核心靶标 将碎叶紫堇碱的成分靶标、DM、IA、COPD和aSAH的靶标分别导入Venny 2.1.0中,绘制韦恩图并获取成分靶标和4种疾病靶标的交集,对靶标进行初步筛选,然后通过STRING数据库绘制其相关的PPI网络(combined_score>0.9),最后对其进行可视化分析并构建化合物和疾病靶点相互作用的网络。

1.5.4 KEGG通路的富集与分析 为了分析碎叶紫堇碱与DM、IA、COPD、aSAH交集靶标具体的功能以及其在KEGG通路中的作用,以人类为研究对象,使用Metascape数据库对筛选出的靶标进行通路的富集与分析,以解析碎叶紫堇碱干预氧化应激性疾病的潜在作用机制。

1.5.5 分子对接验证 取PPI网络中以degree,closeness,betweenness为条件筛选出的核心靶标作为受体蛋白,将碎叶紫堇碱作为配体分子。通过PubChem数据库下载碎叶紫堇碱的2D结构,然后使用软件Chem Draw 20.0.0.41对其进行结构优化,将2D结构转化为3D结构,并将文件格式保存为“mol2”。使用软件Discovery Studio 2019 Client对其进行加氢并产生相应的异构体;通过PDB数据库下载核心靶标受体蛋白的结构,并将文件格式保存为“pdb”,然后通过使用软件Discovery Studio 2019 Client对其进行蛋白修饰,去除靶蛋白中水分子等非蛋白成分和配体。通过软件Discovery Studio 2019 Client对以上两个文件进行CDocker分子对接和LibDock分子对接,CDocker的对接主要是根据配体与受体相互作用的能量(-CDocker Interaction Energy,-ECD)进行评价,而LibDock对接则主要是根据其对接的打分(LibDock score)进行评价。

2 结果

2.1 多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量测定

2.1.1 线性关系及方法检出限 以标准溶液的浓度作为横坐标,对应的峰面积作为纵坐标,绘制标准工作曲线。标准工作曲线方程为y=330.711 8x-1 074.876 4,相关系数为0.997 2;检测线为5 ng/mL;定量线为10 ng/mL。

2.1.2 样品的测定 实验结果显示多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量为0.113 7 μg/mL。

2.2 TLC-Bio分析多刺绿绒蒿的抗氧化活性 根据TLC-Bio的结果可知,显色前薄层板背景为白色(图1A),显色后的薄层板背景变为紫色(图1B),这说明薄层板本身没有抗氧化活性,而显色后的碎叶紫堇碱对照品却显现出明显的黄白色斑点,这说明其具有良好的抗氧化活性。经实验验证当0.058 7 μg/μL的对照品溶液点样量低于1 μL时黄白色斑点不明显。当0.005 87 μg/μL的对照品溶液点样量低于9 μL时几乎无黄白色斑点,即TLC-Bio中碎叶紫堇碱的检出限为0.052 83 μg。

A:普通色谱图;B:生物自显影色谱图。

2.3 网络药理学

2.3.1 碎叶紫堇碱的靶标分析结果 基于Swiss Target Prediction数据库(设定Probability*≥0.1为筛选条件)和Super-PRED数据库(设定Probability≥50%为筛选条件)获取碎叶紫堇碱的靶标,将两个数据库获得的靶标合并去除重复值后,共得到靶标211个,将结果导入Cytoscape 3.7.1绘制化学成分靶点图(图2)。

图2 碎叶紫堇碱的靶标

2.3.2 疾病靶标分析结果 通过DisGeNET数据库下载DM、IA、COPD和aSAH的相关靶标,共获得3 091个相关靶标,对靶标进行筛选(以EI=1为参数指标)后得到2 770个靶标;通过GeneCards数据库下载DM、IA、COPD和aSAH的相关靶标,共获得11 685个相关靶标,对靶标进行筛选(Relevance score>5)后得到4 640个靶标。最终将两个数据库得到的靶标合并去除重复值后得到5 819个疾病相关靶标,绘制化合物疾病靶点图(图3)。

图3 化合物疾病靶点

2.3.3 PPI网络的构建及核心靶标的筛选分析结果 将211个碎叶紫堇碱相关靶标与5 819个疾病相关靶标取交集,最终获得了168个交集靶标(图4)。利用STRING数据库对这168个相关靶标进行蛋白质相互作用的分析(PPI),然后根据得分(PPI得分>0.9)对关键的靶标蛋白进行筛选,最后通过软件Cytoscape 3.7.1构建蛋白质相互作用网络(图5)。图中根据度(degree)值绘制圆形节点的大小;根据结合分数绘制颜色的深浅和连接线的粗细,度值越大就表示该靶点越关键。通过分析可知,SRC、HSP90AA1、EGFR、PIK3R1等靶点可能为碎叶紫堇碱治疗DM、IA、COPD和aSAH的关键靶点。

图4 碎叶紫堇碱与疾病靶点韦恩

图5 碎叶紫堇碱靶标-疾病靶标相互作用网络

通过软件Cytoscape 3.7.1中的CytoNCA功能对构建网络的拓扑性质进行分析,分别以betweenness、closeness和degree的中位数作为阈值(0、0.057 6、3)对其进行筛选,最终获得34个相互作用的核心靶标,结果见表1,绘制34个核心靶标作用图和化合物-核心靶点-疾病图,结果见图6、图7。

表1 核心靶点

图6 34个核心靶标作用图

图7 化合物-核心靶点-疾病图

2.3.4 KEGG通路富集分析结果 通过使用Metascape数据库对34个核心靶标进行KEGG通路的富集与分析,共获得118条信号通路,取按LogP分组的前8条通路绘制通路条形图(图8)。图中条形的长度代表Log10(P)值的大小,条形颜色根据P值着色。

图8 通路条形图

取LogP值最小的前20条通路进行如下分析,结果见表2,表中Log10(P)值表示疾病与通路的相关性,当Log10(P)值越小时其相关性就越强;当富集的相关靶标越多时其数量值就越大。将分析得到的信号通路、筛选后的靶标和化合物分别导入软件Cytoscape 3.7.1中,构建“通路-靶标-化合物”网络(图9)。图9中紫色代表碎叶紫堇碱;绿色代表信号通路;粉色代表核心靶标;连线代表信号通路、疾病靶标和化合物三者之间的关系。最后通过对分析结果进行网络拓扑结构的分析,可知有HSP90AA1、CDK4、CDK2、NFKB1等28个核心蛋白靶标,对应碎叶紫堇碱成分以及Pathways in cancer、Prostate cancer、PI3K-Akt signaling pathway、Viral carcinogenesis等20条通路。

表2 核心靶标KEGG通路富集分析表

图9 通路-靶标-化合物

2.3.5 分子对接结果 以碎叶紫堇碱为配体,利用Discovery Studio 2019 Client软件中CDocker和LibDock功能进行分子对接。最终34个靶点均可进行CDocker对接,29个靶点可进行LibDock对接,5个不可进行LibDock对接。CDocker和LibDock对接结果见表3。取两个模块都可以对接的CDocker 3D作图,结果见图10。

表3 分子对接结果

图10 CDocker 3D结构

3 讨论

被誉为“世界屋脊”的青藏高原具有非常特殊的生长环境,包括气温低、空气稀薄、海拔高、太阳辐射强等特点,正是因为这样的生长环境导致多刺绿绒蒿中富含萜类、黄酮类和生物碱类等成分,其中生物碱类等成分是其特征性成分[20-21]。除了在《藏药志》中记载了绿绒蒿属植物可有效清除体内的过氧自由基外,还有研究表明全缘叶绿绒蒿植株或花的提取物也可以清除多种自由基,在治疗氧化应激方面疾病具有良好的前景[22]。本课题旨在研究多刺绿绒蒿中的碎叶紫堇碱,探讨其在治疗氧化应激方面疾病的作用机制。首先通过HPLC-MS/MS对多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量进行测定,然后通过体外抗氧化实验TLC-Bio证明碎叶紫堇碱的抗氧化能力。 当活性氧(reactive oxygen species,ROS)在机体内过多的产生时,会引起氧化-抗氧化系统的失衡,即氧化应激。氧化应激与许多生理和病理现象有关,当过多的产生ROS时,会对细胞、组织造成损害,从而导致DR的产生[23]。此外,当产生的ROS过多时还会产生炎症。有大量研究表明,IA和COPD的发病机制与氧化应激在炎症级联反应相关[12,24]。aSAH患者致残和死亡的重要原因是由早期脑损伤造成的,而氧化应激反应影响着早期脑损伤的形成[25]。总而言之,DM、IA、COPD和aSAH的发病机制均与氧化应激紧密相关。

本研究通过网络药理学和分子对接技术探索碎叶紫堇碱对治疗DM、IA、COPD和aSAH的作用机制,经筛选获得碎叶紫堇碱作用于4种疾病的34个潜在作用靶点。蛋白质相互作用网络表明HSP90AA1、SRC、ESR1、HIF1A等可能是碎叶紫堇碱通过抗氧化作用治疗DM、IA、COPD和aSAH的关键靶点。其中HIF1A是介导对组织氧水平变化的适应性反应的主要因素,HIF1A在正常氧条件下的细胞中可被泛素化标记实现快速降解,但在缺氧条件下却稳定[26]。HSP90AAl是热休克蛋白家族中重要的成员,由HSP90AA1基因编码的蛋白质可作为同型二聚体发挥作用。ESR1蛋白是配体激活的转录因子,可与雌激素受体2形成同型二聚体或异型二聚体,并影响靶组织中的细胞增殖和分化。有研究表明ESR1和HSP90AA1可以共同调节PI3K/Akt信号通路。经KEGG通路富集结果分析,Pathways in cancer、Prostate cancer、PI3K-Akt等通路直接或者间接参与DM、IA、COPD和aSAH的形成。PI3K-Akt信号通路是一种细胞内信号转导途径,响应细胞外信号,促进代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成。可以通过P13K/Akt通路激活Nrf2/HO-1途径,从而使MC3T3-E1和IPEC-J2细胞不受氧化损伤,降低细胞的凋亡率和ROS[27]。分子对接结果显示关键活性成分与关键靶点间具有较好的结合活性,进一步验证了该研究的预测较为可靠。

通过实验验证、网络药理学及分子对接分析了多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱治疗氧化应激性疾病潜在的作用机制,本研究发现多刺绿绒蒿中碎叶紫堇碱的含量较高且具有良好的抗氧化能力。经分析碎叶紫堇碱通过多个靶点、多条通路协同作用发挥抗氧化应激作用,其可能通过调控PI3K-Akt、Pathways in cancer和Prostate cancer等信号通路中的HIF1A、HSP90AA1和ESR1等关键靶点发挥抗氧化应激作用。