感染是造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)患者死亡的重要原因,尽早明确病原学,是及时、有效抗感染治疗的关键[1]。传统的病原微生物检测方法,以培养法为代表,培养周期过长、且容易受抗生素的影响,不利于临床快速诊断和治疗。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)技术具有所需样本量小、检测快、不易受污染、可检测出培养法不能检测的边缘微生物的优点[2]。对于血液病接受造血干细胞移植患者,由于免疫功能低下,粒细胞缺乏等因素,常出现不明原因发热、重症感染,且规范性经验抗感染治疗无效,对病原学鉴定在常规检测的同时,开展mNGS检测,尽早明确病原菌指导临床治疗,降低感染死亡率[3]。本研究报道6例遵义医科大学附属医院血液科2022年8月至2023年8月mNGS检测在造血干细胞移植治疗血液病疑难感染性疾病的临床运用,旨在探讨mNGS在造血干细胞移植治疗血液病患者疑难感染性疾病中的临床应用价值。

1 临床资料

病例1,男,54岁,诊断:(1)急性髓系白血病(M5型)伴(FLT3-ITD、ΙDH2、ASXL1、DNMT3A、TP53) 突变,预后不良,移植后复发 ;(2)异基因造血干细胞移植术后(姐供弟,10/10,B+供O+移植后复发)。移植+3月形态学复发,停用FK506,于(2023年5月7日)予维奈克拉+阿扎胞苷+吉瑞替尼+供者淋巴细胞输注。泊沙康唑预防真菌,莱特莫韦巨细胞病毒感染,复方磺胺甲恶唑预防耶氏肺孢子菌。2023年5月18日回输供者淋巴细胞(DLI)MNC 1.0×108/L,他克莫司预防急性移植物抗宿主病(Acute graft versus host disease,GVHD),期间无GVHD表现。DLI+14 d外周血见幼稚细胞,考虑化疗+DLI无效。患者出现阵发性刺激性咳嗽,伴发热最高体温38.5 ℃,胸部CT示双肺肺炎,多次血培养阴性,痰真菌培养见多量丝状真菌生长,痰NGS结果肠球菌属序列数2058,相对丰度2.15%,小克银汉霉属,序列数48119,相对丰度50.29%,EB病毒序列数9529,相对丰度4.02%,真菌(1-3)-B-D-葡聚糖97.60 pg/mL,诊断为肺深部真菌感染(毛霉菌),根据中国毛霉菌临床诊疗专家共识(2022版)推荐,两性霉素B胆固醇硫酸酯复合物起始剂量1 mg/kg,逐渐加至3 mg/kg,联合泊沙康唑注射液 负荷剂量 300 mg q12 h,维持剂量 300 mg qd。DLI+28 d,吸氧 4 L/min SPO290%,血气分析 Ⅰ呼吸衰竭,重症肺炎(毛霉菌)及急性呼吸衰竭,予无创呼吸机辅助通气 ,但患者呼吸困难逐渐加重,无创呼吸辅助通气支持下血氧饱和度不能维持,家属不进行有创抢救措施,逐渐出现意识障碍,呼吸循环衰竭,于2023年6月25日宣布临床死亡。

病例2,男,36岁,诊断为极重型再生障碍性贫血,2023年4月12日 患者出现发热,最高体温39 ℃,血培养(2023年4月14日)血培养见金黄色葡萄球菌生长,对万古霉素、利奈唑胺敏感,多次胸部CT未见病灶。逐渐出现右侧小腿、左侧小腿、左侧大腿、右前臂多个皮下结节(较大者约6 mm),考虑脓毒血症(金黄色葡萄球菌)、皮下软组织感染,予万古霉素抗感染3周后,皮下结节逐渐消退,体温正常1周后再次发热,最高体温39 ℃,皮下结节逐渐增大,再次行血培养阴性,CRP 90 mg/L,血象示粒细胞缺乏,外周血NGS见金黄色葡萄球菌,序列数100,相对丰度23%,巨细胞病毒,序列数 24,相对丰度9%,考虑脓毒血症(金黄色葡萄球菌),继续予万古霉素抗感染治疗体温逐渐正常,皮下结节消退。患者行异基因造血干细胞移植术(姐供弟,HLA10/10,A+供O+),移植期间无细胞期无发热,移植+10 d中性粒细胞植活,移植+13 d血小板植活,目前为移植后+3月,血象正常。

病例,3女,34岁,体重40 kg,诊断:(1)急性髓系白血病(M4Eo,伴CBFβ-MYH11、KRAS突变,MRD+,CR1) ;(2)异基因造血干细胞移植术后(妹供姐,10/10,B+供B+,分子生物学复发) 。+3 m CBFβ-MYH11 0.1%,停用FK-506,+4.5 m 出现晚发aGVHD Ⅲ度(肝脏 3级、皮肤2级)。+5 m CBFβ-MYH11 0.15%,aGVHD控制后予阿扎胞苷 75 mg/m2皮下注射维持治疗,2疗程后复查CBFβ-MYH11 0.00%,但期间患者反复出现转氨酶升高,暂停复方磺胺甲恶唑预防耶氏肺包子菌,化疗间歇期患者出现发热,最高体温达40.1℃,伴咳嗽,血常规WBC 4.0×109/L,胸部CT示双肺肺炎,多次血培养阴性,新型冠状病毒阴性,痰细菌、真菌、结核培养阴性,EB病毒DNA阴性,CMV DNA阴性,支原体抗体阴性,C反应蛋白100 mg/L,予美罗培南+万古霉素+卡泊芬净抗感染1周,体温峰值无下降,CRP无下降,伴呼吸困难,血气分析示Ⅰ型呼吸衰竭,复查胸部CT双肺肺炎较前增加。行纤维支气管镜检查肺泡灌洗液m-NGS见耶氏肺孢子菌,序列数 104990,相对丰度73%,支原体属序列数97,相对丰度0.07%,EB病毒,序列数23666,相对丰度73%,肺泡灌洗液真菌、细菌培养均阴性。结合临床诊断为耶氏肺孢子菌肺炎,予停用万古霉素及美罗培南,加复方磺胺甲恶唑 960 mg 口服 1日4次,联合卡泊芬净抗感染3日后体温逐渐降至正常,1周复查胸部CT示双肺肺炎较前明显吸收,2周胸部CT双肺未见异常。

病例4,男,43岁,诊断:(1)输血依赖阵发性睡眠性血红蛋白尿;(2)异基因造血干细胞移植术(非血缘,女供男,9/10,A+供O+)。入移植仓常规肛拭子筛查见大肠埃希菌生长,为ESBL菌。+21 d,患者发热,最高体温39.5 ℃,P 166次/min,BP 87/53 mmHg,诊断:(1)脓毒血症;(2)感染中毒性休克。治疗积极补液,维持器官组织灌注,纠正组织缺氧,去甲肾上腺素0.1 μg/(min·kg)静脉泵入升压治疗。抗感染策略,鉴于目前病原菌尚不明确,患者本次住院曾肛拭子筛查见大肠埃希菌生长,抽血细菌培养+药敏,同时完善血NGS外送结果寻找病原菌,经验性予亚胺培南西司他丁1 g ivgtt q8h广谱强效抗菌药物,覆盖可能引起严重并发症及致命性感染病原菌,因合并肾功能损害,加用利奈唑胺覆盖耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。+22 d下午血培养见革兰氏阴性杆菌生长。血NGS示大肠埃埃希菌,序列数 100,相对丰度 50%,EB病毒,序列数13,相对丰度 10.24%。继续予亚胺培南抗感染治疗,+25 d患者体温正常,循环稳定,逐渐减停去甲肾上腺素,+26 d血培养及药敏结果回示大肠埃希氏菌,对大环内酯类、克林霉素、夫西地酸、利福平天等多重耐药,大肠埃希氏菌对亚胺培南敏感,故继续予以亚胺培南抗菌治疗2周,复查血培养连续2次转阴停用。目前患者为移植+4月,血象正常,一般情况可。

病例 5,53岁,男,诊断为原发中枢弥漫大B细胞淋巴瘤,自体造血干细胞移植术后2月,因发热就诊,最高体温达39.5 ℃,无咳嗽,CRP130 mg/L,PCT 1.16 pg/mL,2022年12月6日胸部CT示心包少量积液,双侧少量胸腔积液,纵膈淋巴结增多,支原体、衣原体抗体阴性,新型冠状病毒阴性,先后予美罗培南+万古霉素及伏立康唑抗感染1周,患者体温峰值无下降,持续高热,逐渐出现呼吸困难,期间多次血培养阴性,痰找结核杆菌阴性,T-SPOT阴性。2022年12月14日复查胸部CT示双侧胸腔积液,左下肺压缩性肺不张,行左侧胸腔穿刺抽液为淡黄色,胸水生化常规为渗出液,ADA正常,胸水送NGS示分枝杆菌属序列数24,相对丰度0.07%,种属为结核分枝杆菌复合群,BK 多瘤病毒,序列数6,相对丰度8%;外周血NGS示分枝杆菌属,序列数34,相对丰度0.14%,种属为结核分枝杆菌复合群,EB 病毒(EBV) ,序列数7,相对丰度0.42%。故诊断为双侧结核性渗出性胸膜炎,予异烟肼+乙胺丁醇+莫西沙星抗结核治疗4日后体温逐渐恢复正常,2周后复查胸部CT双侧胸腔积液吸收。

病例6, 58岁,男患,诊断:(1)急性髓系白血病伴(CEBPA双突变、FLT3-TKD+) 预后不良;(2)拟行异基因造血干细胞移植(弟供兄,HLA 10/10,B+供B+)。患者HA诱导化疗期间,粒细胞缺乏期出现发热,伴咳嗽,2022年6月8日胸部CT示右肺下肺大片渗出、实变,考虑肺部真菌感染可能,予头孢哌酮他唑巴坦联合伏立康唑抗感染1周后复查胸部CT双肺渗出较前减少,院外间断口服伏立康唑抗真菌治疗,经中剂量阿糖胞苷巩固2疗程治疗后,拟行异基因造血干细胞移植术,移植前查体复查胸部CT示(2022年10月10日)双肺肺炎,双肺小结节,多次痰真菌培养阴性,真菌D葡聚糖阴性,为明确肺部感染病原菌,纤维支气管镜肺泡灌洗液真菌、细菌涂片及培养均阴性,m-NGS烟曲霉菌,序列数500,相对丰度10%,巨细胞病毒,序列数 23,相对丰度2.5%,明确肺侵袭性真菌病(烟曲霉菌),予连续输注伏立康唑抗真菌治疗2月,伏立康唑口服1月,顺利行异基因造血干细胞移植术,移植期间继续伏立康唑抗真菌治疗,肺部真菌感染无复燃,目前为移植+5月,患者无病生存中。

2 结果

6例血液病患者临床特征、有临床意义mNGS结果及治疗转归(表1)。

表1 6例血液病患者临床特征、有临床意义mNGS结果、治疗方案调整及转归

3 讨论

血液病接受造血干细胞移植患者,长期使用免疫抑制剂、中心静脉置管、粒细胞缺乏、免疫功能尚未重建等因素导致感染发生率高,HSCT后感染因素复杂,病情危重,进展迅速,是血液病患者死亡的重要原因[4-6]。感染的常见病原微生物包括细菌、真菌、病毒、耶氏肺孢子菌、结核杆菌等,感染部位常见肺部、血流感染、中枢神经系统等[7]。病原微生物的早期检测对于改善血液病患者的预后尤为重要。mNGS可以快速、高效、准确获得检测样本中所有核酸信息,分析出致病病原体,指导临床诊断和治疗,在疑难感染性疾病中发挥着重要作用[8-9]。孙佳慧等[10]研究对异基因造血干细胞移植术后出现局部或全身感染症状的83例患者临床样本进行mNGS检测,83例患者共送检112份临床样本进行了mNGS检测,共确定病原微生物34种。病原菌分布中,细菌最常见为大肠埃希菌(4/17),真菌以白色念珠菌(2/10)常见。病毒以细环病毒30.2%(39/129)、CMV 25.6%(33/129)、EBV 14.0%(18/129)常见。以常规检测手段为金标准,mNGS敏感性为86.5%,特异性为45.0%。

本研究中,6例患者用mNGS检测其外周血、痰液、胸水、肺泡灌洗液标本,共检出病原微生物13种病原菌,病例1痰检出小克银汉霉属、肠球菌属、EB病毒,病例2外周血检出金黄色葡萄球菌,病例3肺泡灌洗液检出耶氏肺孢子菌、EB病毒、支原体,病例4外周血检出大肠埃希菌、EB病毒,病例5胸水检出分枝杆菌属、EB病毒,胸水检出分枝杆菌属、多瘤病毒,病例6检出烟曲霉菌。6例患者中传统方法检出的病原菌中,病例1痰真菌培养见丝状真菌,EBV DNA阴性,病例2外周血培养检出金黄色葡萄球菌,病例3肺泡灌洗液细菌、真菌、结核检查阴性,EBV DNA阴性,病例4外周血培养见大肠埃希菌,EBV DNA阴性,病例5 血培养阴性,痰找结核杆菌阴性,EBV DNA阴性,病例6例,肺泡灌洗液真菌、细菌培养阴性。结合临床及常规培养结果,有意义的病原菌中,小克银汉霉属1例,金黄色葡萄球菌1例,耶氏肺孢子菌1例,分枝杆菌属1例,烟曲霉菌1例,大肠埃希菌1例。

mNGS对于少见和难培养病原微生物检测具有显著优势,但敏感性极高,其可能出现假阳性或假阴性,结合其他检测方法可降低错误诊断的几率[9, 11-12]。从临床角度,mNGS结果不能单独作为病原学确诊或排除的证据,同时不是所有患者都可进行mNGS检测,严格掌握适应症并结合临床及传统检测方法进行综合判断[11, 13]。对于血液病行造血干细胞移植患者合并感染,常规病原学检查未能明确致病原或规范性经验抗感染治疗无效,或者临床怀疑罕见或非典型病原菌感染以及可能并发危及生命的严重感染,建议进一步完善常规病原学检测的同时开展mNGS检测[3, 14-18]。林良康等[19]研究表明血液病合并耶氏肺孢子菌的临床感染诊断需结合临床症状、影像及实验室检查,病原mNGS可为该类感染提供病原学证据支持以辅助指导肺孢子菌肺炎的诊疗。乔薇等[20]研究表明外周血mNGS检测结果可作为替代方法用于难以获得感染灶样本的脓毒症患者病原学诊断。张梦月等[21]研究证实mNGS在结核性胸膜炎中的诊断价值,可作为一种快速诊断PTB的辅助工具。周群等[22]研究表明BALF的mNGS是鉴定非中性粒细胞减少肺曲霉感染的高效实用手段,在发现共病原及调整治疗方案上尤具优势。本研究中,6例患者2例血流感染、3例疑难危重肺部感染、1例非典型结核菌感染,在完善常规病原学检测的同时开展mNGS检测,对外周血、深部痰液、肺泡灌洗液、胸水标本进行mNGS检测,结合临床及传统检测结果分析,有临床意义的病原菌中,小克银汉霉属1例,金黄色葡萄球菌1例,耶氏肺孢子菌1例,分枝杆菌属1例,烟曲霉菌1例,大肠埃希菌1例。根据m-NSG检出病原菌治疗方案改变情况,升级或者调整抗生素4例,维持原治疗方案2例。治疗转归,死亡1例,好转5例。

mNGS灵敏度高,检出的病原菌,建议临床医师结合传统培养方法,综合判断其临床价值。对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物,如分枝杆菌属、诺卡菌属、曲霉菌、毛霉菌等,即使在检测报告中序列数较低,也要考虑其为致病微生物的可能,并采用其他方法验证,如特异引物的 PCR或一代测序等分子生物学检测,G试验,GM试验[14]。mNSG报告解读中,检出序列数是真实测到的微生物的序列条数,是一个绝对值的指标,因此是检测到该微生物最直接的体现,更适合作为报告解读的主要指标。相对丰度值代表该微生物在检出的同类所有微生物中的占比,是一个相对值的指标,占比数值会受到标本中背景菌因素的影响,比如同一种微生物在不同背景菌标本中相对丰度可能会出现很大差别,因此建议可做报告解读的参考但不作为主要指标。目前我国主要使用的病原mNGS检测手段仍属于定性检测水平,序列数高低不等同于病原载量,应审慎应用于疗效评价,同时应结合人源背景、测序数据量等综合评估。此外,对于不同样本之间因实验流程、人源比例均存在较大差异,不可直接进行序列数比较来评估疗效[23]。本研究中,病例5血及胸水mNGS检出结核分枝杆菌,虽然结核分枝杆菌序列数少,但临床仍有意义,且抗结核治疗有症状好转。

血液病患者mNGS检出病毒常见,且往往可有多种病毒检出,并非均是感染病原,同时,病毒检出不等同于病毒复制,需结合核酸定量PCR检测评估其载量。如mNGS阳性但定量PCR阴性,需谨慎判断为病原的可能[23]。本研究中,6例患者均检测病毒,以CMV 和EB病毒常见,但结合CMV和EBVDNA结果阴性,均不考虑感染病原。

本研究的局限性在于病例数较少,不能通过统计学方法评价确切的效果,有待进一步扩大病例数。

因此,对于血液病行造血干细胞移植患者合并感染,在常规病原学检查未能明确致病原或规范性经验抗感染治疗无效,或者临床怀疑罕见、难培养病原菌或非典型病原菌感染以及可能并发危及生命的严重感染时,建议在进一步完善常规病原学检测的同时开展mNGS检测。mNGS检测在不同病原微生物导致的感染性疾病中的临床应用有其优势,反思其局限性,敏感性极高,其可能出现假阳性或假阴性,结合患者临床及其他检测方法进行综合判断,以便有助于临床诊疗。