呼吸系统由鼻、咽、喉、气管、支气管、肺等组织器官组成,临床上常将呼吸系统从功能上分为上呼吸道和下呼吸道[1]。上呼吸道的主要作用是气体的运输,鼻、咽、喉统称为上呼吸道。下呼吸道起始于气管及气管以下的气体通道直至肺泡结构,下呼吸道不仅是空气通过的管道和气体交换的场所,同时具有防御、清除异物、调节空气温度和湿度的作用。呼吸系统中,喉作为发声器官与发音有关,鼻同时作为嗅觉器官与嗅觉相关。本研究主要分析树鼩鼻、喉、器官和肺部作为呼吸系统的组织结构,同时兼顾喉作为发声器官的组织学特征,鼻作为嗅觉器官的组织学特征。

树鼩(tupaiabelangerichinensis)外形似松鼠,是一种小型哺乳动物,树鼩作为实验动物资源之一,与人类和非人灵长类关系密切[2-3],已有学者提出树鼩具有替代非人灵长类动物的价值[4]。啮齿类动物在呼吸系统中的研究丰富[5],而树鼩作为实验动物的研究相对啮齿类动物较少。但树鼩与人类共有某些啮齿类动物不具备的生物学结构[6-9],已在消化系统[10-11]、神经系统[12]、免疫系统[13]等多系统中作为模型动物进行使用。树鼩具有体型小、群居生活的习性、多胎繁殖且繁殖速度快等特点,是树鼩成为实验动物的优势。出于动物福利需求和实验成本需求考量,树鼩因其与人和非人灵长类基因组学层面的相似性,结合其繁育特性等自身特殊性被建议作为生物医学研究、药物有效性药理研究、药物代谢相关研究和安全性测试中灵长类动物的替代动物。树鼩在呼吸系统中尤其是病毒感染的模型中有较多优势并已得到广泛的应用[14-15],但目前尚无树鼩呼吸系统特点的全面研究。本研究以正常树鼩作为研究对象,通过组织学全面研究树鼩呼吸系统重要器官如鼻、喉、气管、肺的特点,明确树鼩作为实验动物在呼吸系统方面的价值,为树鼩在呼吸系统中的应用提供组织学基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 正常成年树鼩6只,2～3岁龄,体重130～145 g。树鼩由中国科学院昆明动物研究所[SCXK(滇)K2022-0003]提供,饲养于成都合拓创展生物科技有限公司[SYXK(川)2021-242]。所有操作均按照我国《实验动物福利伦理审查指南(GB/T 35892-2018)》要求进行。树鼩饲养于普通环境,人工照明,12/12 h昼夜明暗交替,相对湿度40%～60%,温度控制在20～25 ℃,自由饮水自由摄食。本试验经成都合拓创展生物科技有限公司伦理委员会批准(NO:2022IINHT01 T01)。

1.1.2 主要试剂与仪器 异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);多聚甲醛(武汉赛维尔生物科技有限公司);无水乙醇、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司);环保型脱蜡透明液(武汉赛维尔生物科技有限公司)。ABS型呼吸麻醉机(上海玉研科学仪器有限公司);RM2016病理切片机(上海徕卡仪器有限公司);JB-P5包埋机(武汉俊杰电子有限公司);KD-P组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司);PH100生物显微镜(凤凰光学股份有限公司)。

1.2 方法 过量异氟烷吸入麻醉安乐死6只树鼩,分别对鼻、喉、器官和肺组织器官取材并大体观察,组织器官取材后4%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋切片,4 μm厚度切片,苏木素-伊红(HE)染色后封片,使用生物显微镜进行相应器官组织结构观察,图像采集及分析。

2 结果

2.1 树鼩鼻组织学形态观察 鼻是呼吸系统的起始部。树鼩鼻部较小,可进行整个鼻部的包埋固定和切片,为整体展示树鼩鼻部完整结构,对树鼩鼻部整体切片HE染色后以全景扫描的方式呈现(图1A)。树鼩鼻尖主要由软骨(黑色箭头)构成支撑结构;鼻尖处表皮由较厚的富含角质层的复层扁平上皮(黄色箭头)构成,可见部分角质层正在脱落(图1A、A1～3)。鼻前庭有毛区为充分角化的复层扁平上皮(绿色箭头),在上皮基底区可见色素细胞和色素颗粒沉积,该色素细胞和色素颗粒沉积与树鼩鼻呈现棕黑色有关(图1 A1～3)。树鼩鼻腔由鼻中隔(黑色空心箭头)从正中隔开(图1 A4～5),分为左右两侧鼻腔。两侧鼻腔的形成使得鼻腔表面积增加,有利于充分接触和吸入空气,鼻腔的组织结构可以从功能不同的角度分为呼吸部和嗅部。呼吸部鼻腔的上皮由两种上皮类型构成(图1 A6),分别是复层柱状上皮(橘色箭头)和假复层纤毛柱状上皮(紫色箭头),纤毛的作用主要是运送鼻腔黏液,黏附空气中较大的异物颗粒并促进排出鼻腔外。树鼩鼻皮下组织较少(图1 A7～A9),但富含腺体(蓝色箭头)和神经(红色箭头)。树鼩鼻甲上皮的杯状细胞数量比鼻中隔上皮更多,树鼩呼吸部黏膜中的腺体主要是浆液腺,还有部分黏液腺,未见浆黏液腺和黏浆液腺。在鼻中隔前部、中鼻道等区域,浆液腺极其丰富。浆液腺作用主要是分泌的浆液可雾化吸入的空气,使空气充分湿润,减少对下呼吸道的刺激性。鼻同时作为嗅觉器官,从功能角度来看,鼻腔嗅部分布于在上鼻甲和鼻中隔部分,可见嗅黏膜,嗅黏膜和呼吸黏膜交界区不清,嗅黏膜的嗅上皮可见嗅腺,嗅黏膜上皮中含嗅神经。

A:树鼩鼻部切片HE梁色全景扫描;A1～A3:树鼩鼻前庭上皮组织;A4:鼻中隔;A5:鼻软骨;A6:鼻呼吸部上皮组织;A7:鼻部腺体;A8:鼻部神经;A9:鼻部腺体及神经混合区域;黑色箭头:软骨;黑色空心箭头:鼻中隔;黄色箭头:扁平上皮;绿色箭头:复层扁平上皮;橘色箭头:复层柱状上皮;紫色箭头:假复层纤毛柱状上皮;蓝色箭头:腺体;红色箭头:神经。

2.2 树鼩喉组织学形态观察 树鼩喉既是呼吸器官也是发声器官,支撑树鼩喉部发声功能的是对称的声带结构(图2红色箭头),其声带室壁上皮为假复层纤毛柱状上皮(图2紫色箭头),声壁部分可见甲状软骨(图2黑色箭头),除上皮和软骨外,其他层次不清,固有层和黏膜下层均为疏松结缔组织。

红色箭头:声带;紫色箭头:假复层纤毛柱状上皮;黑色箭头:软骨。

2.3 树鼩气管组织学形态观察 和大多数哺乳动物一样,树鼩气管由黏膜下层、固有层和黏膜层三层结构组成(图3A)。树鼩黏膜下层(图3B)由疏松结缔组织构成,与固有层无明显分界,黏膜下层含有较为丰富的血管、淋巴管和神经组织(红色箭头)。气管最内层为黏膜层(图3C),由假复层纤毛柱状上皮构成(紫色箭头),纤毛有助于气体运输并黏附异物分子以保护肺脏。

A:整体结构;B:树鼩黏膜下层;C:树鼩黏膜层;红色箭头:神经;紫色箭头:假复层纤毛柱状上皮。

2.4 树鼩肺组织学形态观察 树鼩肺部大体结构与人类非常相似(图4)。其包膜完整,肺部主要由肺泡,肺泡隔,肺泡囊组成,其间有各级支气管,切片未见高于细支气管等级的支气管结构(图4A)。下呼吸道由各级支气管组成,图4A中可见终末细支气管(黑色空心箭头),终末细支气管上皮为纤毛柱状上皮细胞(图4B黑色箭头),肺泡内杯状细胞、腺体和软骨等结构均不可见。下呼吸道尤其是肺泡是肺部完成气体交换功能的主要部位,树鼩肺可见呼吸性细支气管(橘色箭头)、肺泡管(蓝色箭头)、肺泡囊(图4C绿色箭头)。与人类一致,树鼩呼吸性细支气管的管壁不是完整的闭合状态,而是开口于肺泡,开口处可见由环形平滑肌构成的膨大部(红色箭头)。呼吸性细支气管向下分支为肺泡管,其管壁由肺泡组成;肺泡囊与肺泡管相连,无膨大部。肺泡隔较薄,肺泡可见I型肺泡细胞(细胞较大,扁平状)和Ⅱ型肺泡细胞(颗粒状,细胞核圆)。

A、B、C树鼩肺部结构;黑色空心箭头:终末细支气管;黑色箭头:纤毛状柱状上皮;橘色箭头:呼吸性细支气管;蓝色箭头:肺泡管;绿色箭头:肺泡囊;红色箭头:呼吸性细支气管膨大部。

3 讨论

从基因同源性角度出发,树鼩比犬和啮齿类动物更接近人类,也更接近非人灵长类动物[7,16-17]。机体器官的组织结构是为器官实现其功能服务的,树鼩的许多组织器官功能和解剖结构比犬和啮齿类更接近于人类[6,18]。树鼩呼吸系统的上呼吸道黏膜上皮主要为纤毛上皮,在呼吸中能够起到运送气体,排出黏液,吸附尘埃或者异物的作用。树鼩的细支气管肌肉层较大小鼠更发达,同时细支气管上皮中可见杯状细胞。啮齿动物类中大小鼠气管上皮均较人类薄,其中小鼠更薄,树鼩气管上皮相对较大小鼠更厚,但依然较人类薄[19]。小鼠和兔细支气管上皮缺少杯状细胞,这和人类差别较大,树鼩细支气管上皮含有少量杯状细胞[20]。在黏膜下腺体分布方面,人类和非人灵长类主要以混合腺体为主,而大小鼠混合腺体较少,兔最少,树鼩较啮齿类动物混合腺体数量偏多[21]。本研究在树鼩的肺部组织中未观察到高于细支气管等级的支气管结构,该研究结果与Treuting等[19]相似,在体型较小的实验动物物种肺部结构中均出现这种情况,这可能和动物体型的关系较大。在树鼩鼻的结构中,看到鼻上皮主要由含有纤毛的上皮构成,鼻部主要为气体经过的通道。同时鼻作为嗅觉器官,含有嗅部组织结构,为独特的嗅黏膜上皮。喉作为呼吸器官和发声器官,喉大部分结构上皮均为富含纤毛的上皮组织,同时喉具备声带、甲状软骨等结构,支持其发声功能。树鼩鼻、喉、肺与人类呼吸系统特征完全一致。

因树鼩与人类较为相似或较其他啮齿类动物更为接近,已经有部分关于使用树鼩制备人类呼吸系统疾病动物模型的相关研究[14,22-25],该系列研究均证明了树鼩的疾病反应与其他实验动物相比似乎更加接近于人类,这也许和树鼩呼吸系统组织结构与人类极为相似有关。使用博来霉素诱导的树鼩肺纤维化,与人类肺间质纤维化的拥有共同纤维化反应,且促纤维化信号通路一致[14]。在树鼩的类风湿相关模型研究中,其疾病进展出现了与人类一致的类似于间质性肺炎的肺部炎症反应特征[2]。一项有关树鼩诱导原位肺癌的研究指出树鼩在肺部结构,功能和代谢方面都与人类更为接近,且肺癌表现与进展与啮齿类动物相比与人类更相似[15]。树鼩感染流感病毒的疾病表现和发病进程与人类的流感病毒感染非常相似[24],感染寨卡病毒的树鼩表现出与人类临床感染寨卡病毒一致的皮疹症状[23]。因此,树鼩在呼吸系统的研究中,具有重要且独特的价值。本研究展示了正常成年健康树鼩呼吸系统主要组织器官的组织学结构和形态,为树鼩作为实验动物与人类较为相近,提供进一步细胞及组织学层面的证据,补充完善树鼩的呼吸系统的基础研究,并且为树鼩制备呼吸系统疾病动物模型提供组织学基础。

本研究具有一定局限性,研究主要目的在于补充树鼩作为新兴模式动物呼吸系统基础性数据,所以实验设计较为简单,文章将全部重点关注于树鼩呼吸系统主要组织器官的形态学研究,力争通过这篇文章将组织形态特征尽数呈现。文章使用的研究方法单一,在后续的研究中,将陆续开展与创新药物研发靶点相关的信号通路在树鼩呼吸系统中的表达和调控,为树鼩作为模式动物提供更加详尽的基础数据。