顾瑛媛,张春菲,张浩洪,吴 招,邹楠婷,莫庆艳,巨鸣谦,万春平△

(1.常州市中医医院,江苏 常州 213003;2.云南中医药大学第一附属医院,云南 昆明 650021)

脑缺血(cerebral ischemia,CI)是一种临床上常见的急性脑血管疾病,患者会发生类似于脑出血或脑梗塞的临床表现,长期的脑缺血可能会引发持久性或进行性的神经功能和认知功能障碍[1]。脑缺血是致残的主要原因,是世界范围内仅次于心血管疾病和癌症的第三大死亡原因,其发病率随着年龄的增长而上升[2]。大脑对缺血反应非常迅速,仅仅几秒钟的时间大脑功能就会受损,但仍是可逆的。持续几分钟或更长时间的脑缺血可能会引发一系列连锁反应,最终导致细胞损失或是其他结构发生变化导致不可逆转的缺陷[3]。临床治疗缺血性脑损伤的原则之一是尽早恢复血液再灌注,这将有助于减轻缺血性脑损伤,使某些不可逆损伤至少在功能上得到恢复。但是,脑缺血后再灌注也可能会引起脑损伤,导致脑水肿、脑出血和神经元死亡,这种现象称为脑缺血/再灌注损伤(I/R)[4]。因此积极研发减轻脑I/R损伤治疗方法,是降低患者死亡率和致残率的重要手段。

瓜子金为远志科(polygalaceae)远志属(polygala)植物瓜子金(polygalajaponicaHoutt.)的全草。具有祛痰止咳,活血消肿,解毒止痛功效,用于咳嗽痰多,咽喉肿痛;外治跌打损伤,疔疮疖肿,蛇虫咬伤等症[5-8]。瓜子金中的主要成分包括皂苷类和黄酮类化合物,另外还有口山酮类化合物、多糖等。研究已表明,瓜子金及活性成分具有神经保护作用,对缺血再灌注损伤具有显著的治疗作用,但确切的抗缺血损伤的作用靶点及活性成分尚未明确。因此本研究通过网络药理学鉴定其活性成分成分,预测其潜在的作用靶点及机制,为民间常用草药瓜子金进一步研究和应用提供思路和方法。

1 材料与方法

1.1 软件与网站 数据库和软件主要包括:化源网(https://www.chemsrc.com/)、TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmcp.php)、Pubchem数据库、GeneCards数据库、Uniport 数据库(http://www.uni-prot.org/)、STRING数据库、OMIM数据库、TTD数据库、ETCM数据库、DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org/)、VENN图软件、Cytoscape3.8.0软件、R4.1.1软件等。

1.2 瓜子金的活性成分及靶点预测 前期根据国内外文献调研寻找瓜子金中所含的化学成分[5-11],利用化源网查询其各个化学成分的CAS号,TCMSP数据库检索所有化学成分,以口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18[13]为标准进行相关活性成分筛选。通过 TCMSP 数据库筛选活性成分对应靶标,将筛选的靶标成分与UniProt数据库进行匹配,得到靶标基因。再利用Cytoscape3.8.0软件构建瓜子金活性成分-作用靶点网络。

1.3 脑缺血相关基因靶点的筛选 通过OMIM、TTD、TCMSP、ETCM、DisGeNET和GeneCards数据库检索与脑缺血相关基因。为了使结果更加全面准确,所使用检索词cerebral ischemia进行检索,获取与脑缺血相关基因。

1.4 瓜子金活性成分靶点与脑缺血相关靶点相互作用网络构建与分析 瓜子金活性成分靶点基因和脑缺血相关基因两者利用R语言韦恩图进行合并,得到两者合并的VENN图,图中交集的部分即瓜子金活性成分治疗脑缺血的靶点基因,导出基因-疾病TSV文件。利用Cytoscape3.8.0软件构建瓜子金活性成分-疾病-作用靶点网络,通过网络分析结果制作药物-疾病-靶点网络可视图。

1.5 蛋白互相作用网络的构建与核心靶点的分析 将瓜子金活性成分与脑缺血共同靶基因导入String 数据库,设置连接评分最小值为 0.900,得到蛋白互作关系导出TSV文件。利用R语言计算各主要蛋白之间的互作次数和核心靶点,筛选出前30个核心靶点作PPI网络核心基因可视化图。

1.6 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析 GO 富集分析包括生物过程、分子功能和细胞组分,阐明在生物过程、分子功能和细胞成分方面哪些基因的代表性过高或过低[14-15]。首先将共同靶基因转换成 entrezID,在R软件安装“Bioconductor”包,输入药物和疾病靶点文件,将其基因名转换为entrezID,根据已转换的entrezID,以P<0.05进行关键靶基因的 GO 和 KEGG 功能富集分析,结果均以条形图和气泡图形式展示。

2 结果

2.1 瓜子金活性成分及靶点预测 通过筛选条件,从 TCMSP 数据库中共获得瓜子金4个活性成分,结果如表1。通过 TCMSP 数据库预测和Uniprot 数据库校正去重,共获得144个化合物相关潜在靶点,利用Cytoscape3.8.0软件构建瓜子金活性成分-作用靶点网络,结果见图1。

2.2 脑缺血相关基因靶点的筛选 通过OMIM、TTD、TCMSP、ETCM、DisGeNET和GeneCards数据库检索与脑缺血相关基因,通过条件筛选其中OMIM数据库中得到192个相关基因靶点,TDD数据库得到4个,TCMSP数据库得到6个,ETCM数据库得到58个,DisGeNET数据库得到118个,GeneCards数据库得到1550个,筛除相同的基因靶点得到总的脑缺血相关基因靶点有1671个。

2.3 瓜子金活性成分靶点与脑缺血相关靶点相互作用网络构建与分析 将瓜子金活性成分靶点基因与脑缺血相关基因用R语言韦恩图进行合并,制作出VENN图,交集的靶点基因共有105,结果见图2。推测这些可能为瓜子金治疗脑缺血的基因靶点。通过 Cytoscape3.8.0软件构建瓜子金活性成分-疾病-作用靶点网络,结果见图3。图中黄色代表药物与疾病共同基因,蓝色代表瓜子金的有效成分,并对该网络图中的每个节点的 Degree 进行分析。可得出前4位核心成分为常春藤皂苷元(hederagenin)、槲皮素( quercetin)、山奈酚(kaempferol)、1,3,7-三羟基-9H-氧杂蒽-9-酮(Gentisein)分别能与15、132、55、5个关键靶点连接,其中对治疗脑缺血具有重要的意义,具体见表1,选取 Degree≥3 的活性成分进行展示。

图3 瓜子金活性成分-疾病-作用靶点网络

2.4 蛋白互相作用网络的构建与核心靶点的分析 蛋白互作网络图中节点表示蛋白,边表示蛋白之间的关联,网络图中的最小互助得分为>0.900,共涉及105个节点,374条边,平均度为 7.12,结果见图4。利用R语言计算各主要蛋白之间的互作次数,并据此找到核心靶点,筛选出前30个核心靶点作PPI网络核心基因可视化,结果见图5。左侧为前30个核心基因名称,X轴代表其节点数目,共获得AKT1、IL-6、TNF、IL1B、CASP3、TP53、JUN、MMP9、PTGS2、CXCL8、EGFR、HIF1A、PPARG、MYC、HSP90AA1、IL10、CCND1、FOS等核心蛋白。

图4 PPI蛋白互作网络

图6 GO富集分析柱状图(前20)

图7 GO富集分析气泡图(前20)

2.6 KEGG通路分析 对105个共同靶点进行KEGG通路富集分析,显示参与 KEGG代谢通路共有163条,筛选前20 条发现通路主要与AGE-RAGE信号通路、血脂和动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Th17 细胞分化、乙肝、PI3K-Akt信号通路和C型凝集素受体信号通路等相关,结果见图8～图10。相关通路涉及到炎症反应、细胞凋亡与免疫调节等多个环节,提示瓜子金可能通过调控该信号通路从而起到治疗作用及调节多种代谢通路共同发挥治疗脑缺血的作用。

图8 KEGG通路分析柱状图(前20)

图9 KEGG通路分析气泡图(前20)

3 讨论

瓜子金为远志科(polygalaceae)远志属(polygala)植物瓜子金(polygalajaponicaHoutt.)的干燥全草,《中国药典》2015 年版一部收载用药,瓜子金又名瓜子草、来麻回、散血丹、小远志、金锁匙、地藤草[6-8]。“瓜子金”是一种广泛分布于中国南方的多年生草本植物。全草在民间医学中被用作祛痰、消炎和抗菌药物,主要含有黄酮、皂苷和类固醇等活性成分[16]。研究表明,远志属植物瓜子金的药理活性包括:抗抑郁、抗炎作用、改善学习记忆和减轻认知障碍、抗肿瘤、抗肝癌和抑制乙肝病毒及保肝作用、抗血和凝血作用、保护心脑血管、抗衰老、镇静催眠作用及神经保护作用等[17]。临床上主要用于治疗骨髓炎、关节炎、失眠症等疾病。已有研究表明,瓜子金皂苷己对缺血再灌注损伤的神经细胞具有明显的保护作用[18],然而确切的作用机制尚未明确,有待进一步研究。

本研究通过网络药理学证实,从瓜子金中所含9个皂苷成分和41个黄酮类成分中筛选得到4个活性化合物,分别是常春藤皂苷元、槲皮素、山奈酚、1,3,7-三羟基-9H-氧杂蒽-9-酮,在脑缺血中相关靶点有1671个,瓜子金活性成分与疾病共作用靶点有105个,通过对交集基因进PPI互作分析发现,AKT1、IL6、TNF、IL1β、CASP3、TP53、JUN、MMP9、PTGS2、CXCL8、EGFR、HIF1A、PPARG、MYC、HSP90AA1、IL10、CCND1、FOS、IFNG等为关键基因。进一步分析这些靶点和交集基因,瓜子金可显著抑制炎症反应和介导免疫调节作用,以上核心成分可能作为瓜子金治疗脑缺血的主要药效群。KEGG通路富集结果中,其通路包括AGE-RAGE信号通路、血脂和动脉粥样硬化、Toll样受体信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、IL-17 信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Th17 细胞分化、乙肝、PI3K-Akt信号通路和C型凝集素受体信号通路等。血脂代谢和动脉粥样硬化以及流体剪切应力与动脉粥样硬化与脑缺血发病密切相关,已作为短暂性脑缺血发作的重要危险因素[19-20],而AGE-RAGE信号通路一组特异性组合,通过激发多种细胞因子的形成与释放,导致机体神经、血管的病理改变。同时导致氧化应激的发生,进而激活NF-κB信号通路,使血流调节受损,导致神经内膜血流灌注减少[21]。肿瘤坏死因子信号通路、IL-17 信号通路和Th17 细胞分化为治疗脑缺血的关键炎症通路。肿瘤坏死因子(TNF)作为关键的炎症细胞因子,参与细胞凋亡、炎症和免疫,诱导全身炎症反应,IL-17家族可激活MAPK,NF-κB和C/EBPs途径中的抗细胞因子和趋化因子,在免疫炎症介质的产生、免疫细胞的趋化迁移等发挥关键作用[22-23]。PI3K-Akt信号通路参与细胞生长、转录、翻译、细胞增殖、细胞运动及糖原代谢,同时PI3K/AKT信号通路参与星形胶质细胞Cx43的调节可能会对脑缺血损伤引起的氧化应激、炎症反应和细胞凋亡具有神经保护作用[24]。Toll样受体信号通路中Toll样受体TLRs广泛分布在免疫细胞尤其非特异免疫细胞以及某些体细胞表面,它是生物一种模式识别受体,通过识别病原相关分子模式PAMPs来启动免疫反应。研究表明,Toll样受体4(TLR4)通过其信号通路诱导炎症级联反应,产生大量的细胞因子,是脑缺血再灌注损伤的机制之一,可能成为预防脑缺血再灌注损伤的新靶点[25]。

综上所述,本论文运用网络药理学预测了瓜子金的活性成分及其在脑缺血治疗中的潜在靶点,发现瓜子金中的常春藤皂苷元、槲皮素、山奈酚和1,3,7-三羟基-9H-氧杂蒽-9-酮可能通过调控PI3K-Akt信号通路与Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、AGE-RAGE信号通路、IL-17 信号通路以及药物结合、质膜区响应与神经元影响等生物功能进而影响机体内的免疫调节、炎症反应、细胞生存、细胞周期和细胞凋亡进程,从而发挥对脑缺血的治疗作用,为进一步开发利用瓜子金治疗脑缺血中提供了新的视角和线索,也为深入的机制研究和临床应用提供了方向。但数据库中纳入的信息有一定的局限性,还需进一步通过疾病动物模型和临床进行论证。