史攀博,李亨达,薛宁,方居正,蔡双洁,吴攀峰,周怡,李亚东

1.河南中医药大学,河南 郑州 450046; 2.平顶山市中医医院,河南 平顶山 467099

附子为毛茛科植物乌头AconitumcarmichacliiDebx.的子根的加工品[1],首见于《神农本草经》,是我国常见的药材,至今已有2 000多年历史,广泛分布在北半球国家[2]。中医学认为,附子辛、甘,大热,有毒,归心、肾、脾经,有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛之功效,多用于治疗亡阳虚脱、肢冷脉微、心阳不足、皖腹冷痛、肾阳虚衰、阳痿宫冷、阴寒水肿、寒湿痹痛等症[3]。药理学研究表明,附子中的有效成分具有调节血糖代谢、保护心脏、调节免疫、抗肿瘤、调节神经系统、抗炎、抗氧化、保护肾脏等作用[4]。

《淮南子》曰:“夫天下之物,莫凶于奚毒。”《广雅》注:“奚毒,附子也。一岁为萴子,二岁为乌喙,三岁为附子,四岁为乌头,五岁为天雄。”其有效成分生物碱能够影响心脏功能及中枢神经系统,亦具有肝肾毒性、胚胎毒性等毒理作用[5]。临床上多与人参、甘草等配伍使用,以达到减毒治病的效果[6],如参附注射液可改善炎症反应引起的心力衰竭及心功能下降,抑制癌细胞增殖,促进细胞凋亡[7-8]。本文从附子的药理、毒理以及解毒机制进行分析、归纳,以期全面了解附子的研究动态,促进新药研发,改善患者临床症状。

1 附子药理作用机制

1.1 保护心脏沙索林醇是从乌头中分离出植物基异喹啉生物碱。研究表明,沙索林醇可改善多柔比星(Doxorubicin,DOX)诱导的大鼠慢性心力衰竭,同时改善H9c2心肌细胞线粒体功能。心肌细胞的能量供应依赖于线粒体产生的ATP,DOX通过诱发心肌细胞线粒体功能障碍,致使心脏能量稳态失衡,而沙索林醇能够通过下调线粒体内Ca2+摄取膜蛋白活性,从而阻断线粒体功能障碍,保护心肌细胞[9]。Wen等[10]研究发现,从乌头中分离出的天然苄基异喹啉生物碱的强心作用在于预防DOX诱导的心脏毒性,并通过肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)/腺苷酸活化蛋白激酶α(adenosine monophosphate-activated protein kinase α,AMPKα)/沉默信息调节因子1(sirtuin 1,Sirt1)信号通路促进心肌能量代谢,促进线粒体能量代谢,防止充血性心力衰竭。药理学研究表明,附子亦有调节血压、扩张血管等作用[11]。在一项以附子提取物预防大鼠肾上腹主动脉缩窄手术诱导的大鼠心力衰竭的实验中,小剂量附子总生物碱可通过调节心肌细胞内Ca2+稳态从而恢复心肌的收缩、舒张功能,抑制心肌细胞的肥大、纤维化[12],表明附子中的生物碱成分不仅可以防止心肌细胞损伤、改善心肌代谢,对于血液循环亦有一定的改善作用。

1.2 调节血糖棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)中编码解偶联蛋白1 (Uncoupling protein 1,UCP1)的基因表达,腹股沟和性腺周围白色脂肪组织褐变是能量代谢过程中的重要环节[13]。一项动物实验针对体温过低的小鼠,给予附子水提物调节肠道菌群、胆汁酸代谢,促使小鼠体温升高,结果证实,附子提取物能够通过调节肠道菌群及胆汁酸代谢,促使白色脂肪组织的褐变和BAT的表达,加剧糖类能量代谢,表明附子提取物可通过调节肠道菌群改善糖尿病[14]。线粒体产生的活性氧是导致线粒体损伤的主要原因,线粒体的功能完整与β细胞密切相关,线粒体功能障碍则胰岛素分泌受损,导致糖代谢紊乱,附子水提物可抑制活性氧活性,从而调控血糖的正常代谢[15]。附子水提物可通过调节肠道菌群、机体代谢以控制机体血糖水平,但其具体有效成分及药理作用需进一步探究。

1.3 调节免疫反应自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)是非特异性免疫应答过程中的重要细胞,可通过细胞溶解活性和免疫刺激细胞因子的分泌发挥抗肿瘤作用。最新研究表明,附子煎煮液可增强小鼠自身适应性免疫,抑制H22荷瘤小鼠细胞增殖,促进其细胞凋亡,其主要机制为激活p38促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号转导通路,上调T细胞及NK细胞、改变CD107a和NK受体的表达,增强适应性免疫,从而提高患者自身免疫力[16]。一项采用附子治疗过敏性鼻炎的网络药理学分析表明,其作用机制为介导Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)信号通路。过敏性鼻炎的发生多是人体对尘螨敏感性增加而发生在鼻黏膜上的先天反应,而附子可通过下调TLR对过敏原的敏感性从而减轻过敏症状或降低过敏发生率[17]。胡琦等[18]通过提取生附片多糖治疗H22荷瘤化疗小鼠,对比治疗前后的抑瘤率、免疫器官指数以及血清细胞因子水平,对其疗效进行评价,结果表明生附片多糖可有效增强RAW264.7细胞吞噬能力,且随着小鼠摄入剂量的增加,脾脏指数亦随之增加,表明生附片多糖具有一定的免疫调节作用。附子煎煮液可通过调节免疫细胞、影响TLR信号通路发挥免疫调节作用,治疗癌症及过敏性疾病,然而目前其药理作用仍局限于理论,缺乏临床试验证据支撑。

1.4 抗肿瘤Zhang等[19]研究发现,附子中的C18二萜类生物碱可通过靶向p5 MAPK上调DR1及TNF-R38的表达,使肿瘤细胞膜上的死亡受体与相关配体结合,从而传递凋亡信号,诱导细胞凋亡。附子中的多糖亦具有C19二萜类母核,具有天然的抗肿瘤作用,尤其为肺癌的治疗提供了参考,具有较大的发掘潜力。附子C19二萜类生物碱可以通过上调Beclin-549、LC1-II、Bax和半胱天冬酶-3表达诱导人肺癌A3细胞的自噬和凋亡,同时下调p62和Bcl-2表达,促进自噬和促凋亡相关蛋白的表达,抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡[20]。附子中的生物碱具有抗炎、抗癌、免疫调节等药理作用,而其中的二萜类生物碱对肝癌、肠癌、乳腺癌等均具有治疗效果,但C19二萜类生物碱对心脏、神经的毒性作用研究仍有待完善。

1.5 调节神经附子对神经的调节作用主要包括保护神经损伤、抗抑郁及提高认知。在一项附子通过GRIN1和MAPK1靶点基因治疗阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的研究中,通过将附子的相关成分、靶基因与AD进行关联,发现MAPK1、GRIN1基因不仅参与负责神经元功能的通路,而且在神经元存活相关通路MAPK1/MAPK3的信号传导中发挥作用。附子可通过激活去甲肾上腺素能系统,促进GRIN1和MAPK1基因表达,抑制神经损伤[21]。有动物研究表明,当成年动物海马体的神经发生被辐射破坏时,抗抑郁药物的作用消失。抑郁症导致海马神经元萎缩,而甲乌头碱可能通过去甲肾上腺素作用于肾上腺素能β受体来增加海马神经发生,并逆转海马体萎缩以及海马神经元丢失[22]。神经递质去甲肾上腺素在认知、行为、应激反应和警觉中起重要作用,附子提取物松戈林通过增加CA1区锥体神经元场兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)和突触后群体尖峰,对海马体中的突触传递产生刺激作用,增加去甲肾上腺素,通过增强新颗粒细胞的存活和分化促进海马神经发生,改善患者抑郁症状[23]。突触可塑性是学习和记忆形成的重要基础,包括结构可塑性和功能可塑性。功能可塑性是指突触传递效率的变化,包括长期增强和长期抑制,各种形式的应激会损害长期增强作用,增强长期抑制作用,而附子水提物(去甲诸毛菜碱)可增加去甲肾上腺素,影响突触可塑性,提高学习及认知能力[24]。附子具有防止神经损伤、抗抑郁、改善认知等功效,但甲乌头碱治疗抑郁的作用机制缺乏相关证据。

1.6 抗炎在附子总生物碱通过调节核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)、JAK/STAT信号通路防治类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的研究中,显示NF-κB信号通路的激活可缓解RA患者的炎症反应和关节炎症状,促进白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子的释放,诱导相关受体蛋白激活NF-κB,促进RA相关蛋白和基因的表达,促进免疫细胞的分化,调节细胞内炎症因子,结果表明FTAs可激活NF-κB信号通路,从而逆转促炎细胞因子的失衡,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡缓解RA症状[25]。脑出血患者免疫功能受损,脾脏和胸腺快速萎缩,在草本配方通过增强外周免疫力防治脑出血诱发的肺部感染的研究中,发现含有附子的草本配方组较空白组脾脏胸腺指数、白细胞含量均显著升高,而TNF-α、IL-6等水平降低,其机制可能是激活适应性免疫反应和TLR信号通路,促进免疫细胞的合成和释放,抑制炎症的发生[26]。参附注射液可抑制HMGB1-NF-κB通路相关蛋白和炎症因子在休克大鼠肺组织中的mRNA表达,增加TLR4、IκB-α的表达,降低内毒素休克大鼠肺组织中TNF-α的水平,抑制炎症反应的发生[27]。同时,附子可通过调节NF-κB、HMGB1-NF-κB等信号通路,抑制炎症反应的发生。

1.7 镇痛附子中的二萜类生物碱作为首款非成瘾性镇痛药,被广泛应用于轻度及中度疼痛的临床治疗。二萜类生物碱通过阻断中枢神经系统中的电压依赖性Na通道,影响中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray,PAG)和皮质中的钙内流,刺激与去甲肾上腺素和血清素相关的下降途径,抑制海马神经元的活动,减少生长抑素途径的传递,从而发挥镇痛作用[22]。乌头碱通过激活神经元κ-阿片受体,刺激小胶质细胞中强啡肽A的表达,抑制神经元的电生理活动,以达到镇痛效果[28]。Çankal等[29]在采用不同剂量的卡马西平和乌头碱治疗小鼠三叉神经痛的研究中发现,高剂量乌头碱与卡马西平疗效相似,且具有剂量依赖性,其作用机制可能是通过与通道蛋白α亚基上的神经毒素结合位点2的结合,抑制电压依赖性Na+通道的失活,由于Na+通道活化时间延长,细胞通过持续的Na+内流去极化,兴奋性降低。目前,关于附子多糖的镇痛作用研究较少,活性成分较多,目前已知附子多糖提取物尼奥灵对病理性神经痛有治疗效果,但其镇痛机制有待深入研究。

2 附子毒理作用机制

2.1 心脏毒性附子中的生物碱具有强心、改善循环系统等作用,但其用量不当亦可诱发心脏毒性,导致心律失常[30]。乌头碱可兴奋组织(包括心肌、神经和肌肉)细胞膜的电压敏感钠通道,使其与位点2处电压敏感钠通道的开放状态具有高亲和力,从而导致钠通道的持续激活,产生心脏毒性作用[31]。C19二萜类生物碱可增加RyR2(心肌型兰尼定受体)的表达并显著降低NCX1、DHPR-α1的表达,破坏细胞内Ca2+稳态,减少肌质网Ca2+-ATP酶表达,诱导自发跳动速率、自发振荡幅度,发生心律失常[32]。在乌头碱诱发的双向性室性心动过速的研究中,乌头碱通过迷走神经介导的抗胆碱能作用,兴奋组织中对电压敏感的钠通道结合,在动作电位的去极化期间促进钠离子内流,诱发心动过速[33]。研究发现,乌头碱诱导心脏毒性的主要机制包括细胞活力受损、不可避免的DNA损伤、过度凋亡、心率异常和细胞内钙过载等[34]。乌头碱的心脏毒性作用主要为影响细胞内电解质的紊乱,进而诱发恶性心律失常、传导阻滞等。

2.2 神经毒性附子对神经具有双重作用,药理作用主要为保护神经元,抑制神经损伤,毒理作用主要表现为抑制中枢神经系统出现面部、口腔和四肢感觉异常[35]。乌头碱中毒会破坏神经传递通路,抑制分化的NG108-15神经细胞的延迟整流钾通道,使神经元信号不能正常通过突触,导致四肢控制异常,甚至瘫痪[5]。在HT22小鼠海马神经元细胞的毒性机制研究中,发现乌头碱诱导的谷氨酸增加会引起细胞内Ca2+超负荷,破坏Ca2+的体内平衡,超负荷的Ca2+会诱发神经元氧化应激,导致神经元凋亡[36]。乌头碱毒素还可能损害中枢神经系统,从而导致大脑神经暂时或长期紊乱,严重时会导致休克和昏迷。

2.3 肝、肾毒性随着对中药研究的深入,一些中药肝肾毒性的影响也逐渐显露出来,如黑顺片诱导大鼠肝毒性机制的研究显示,大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT) 、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)升高,其机制在于乌头碱可促进氧化应激和自由基的促氧化生成,并在细胞水平上攻击线粒体,引起细胞毒性,触发细胞凋亡,导致肝脏损伤[37]。Ji等[38]通过短期或长期喂养小鼠乌头制剂,观察附子生物碱在小鼠组织内的累积,结果发现,长期服用附子制剂可导致单酯二萜类生物碱在肝脏、肾脏和心脏中较为明显的累积,造成脏器损伤。二酯二萜类生物碱在肝脏中代谢,经肾脏排泄,运输机制为有机阴离子转运蛋白和有机阳离子转运蛋白在肝细胞和肾小管内皮细胞的基底外侧膜上高表达,经异生素介导转运穿过细胞膜并摄取到器官蓄积,进而损伤肝、肾细胞[39]。以上表明,附子的毒性成分多为有机碱,主要包括单酯二萜类生物碱、二酯二萜类生物碱,可直接作用于肝、肾,发挥毒理效应,但其产生毒理作用的剂量需进一步实验验证。

2.4 胚胎、生殖毒性在乌头碱通过Nrf2-HO-1、JNK-Erk信号通路影响斑马鱼胚胎毒性的研究中发现,高剂量乌头碱可导致斑马鱼胚胎细胞变形、体长缩短、体型改变、心包水肿、卵黄潴留、鱼鳔和大脑发育缺陷以及多巴胺能神经元的退化等,其发育毒性可能与Nrf2/HO-1和JNK/Erk信号通路介导的ROS、氧化应激及线粒体凋亡的激活有关[40]。在乌头生物碱诱导胚胎斑马鱼心脏毒性的研究中,采用不同浓度的乌头碱对胚胎斑马鱼进行干预,结果显示,20 μg·L-1乌头碱可引起心血管系统缺陷,伴卵黄囊出血,受精早期伴有心功能不全[41]。Zhang等[42]采用附子提取物予实验组雄性小鼠灌胃,空白对照组小鼠不进行处理,对比两组雄性小鼠睾丸重量、睾丸比、睾丸组织病理学、精子数量、精子活力率和精子畸形率,评价生殖毒性,结果表明附子可引起生殖毒性,实验组小鼠睾丸重量和睾丸系数降低,精子数量和精子活力率均降低,骨髓细胞中的精子畸形率显著增高,可见附子提取物可降低生殖率。大多数关于附子毒性的研究都集中在心脏和神经毒性上,仅有少数研究揭示了附子对其他器官的毒性,如生殖毒性和胚胎发育毒性,而如何减轻附子的生殖毒性和遗传毒性需进一步研究。

3 附子解毒机制研究

附子应用得当可发挥保护心肌、改善神经损伤、抗炎等药理作用;相反,若应用不当,超过治疗窗口,则易诱发恶性心律失常、神经及生殖毒性等,因此解毒研究显得尤为重要,包括配伍解毒、炮制解毒两方面[43]。

3.1 配伍解毒传统医学讲究辨证,处方不拘泥于某一种药物,而是根据患者不同症状,选择不同药物的配合,不仅可提高药效,还可减少药物毒性[44]。Chen等[45]通过人参-附子药对配伍治疗心力衰竭的机制研究中,发现人参-附子药对可抑制环氧化物水解酶以维持高内源性抗炎介质环氧二十碳三烯酸水平,从而减少炎症,调节内皮张力,改善线粒体功能,减少氧化应激,并激活各种应激反应系统,改善慢性心力衰竭大鼠心肌纤维化,增强心脏功能,降低血清慢性心力衰竭标志物(脑利钠肽)水平。Yan等[46]在乌头与甘草通过TLR4/NF-κB途径减少小鼠炎症和心室重构的研究中,发现附子与甘草的配伍相较于单用附子,可显著改善左心室功能,减少肌损伤,表明附子配伍甘草可提高药效。陈家琪等[47]在附子-大黄药对的机制研究中发现,两药配伍可增强抗炎、镇痛、强心等功效,且大黄鞣质可与乌头碱发生酸碱中和反应而使附子脱毒,表明附子-大黄药对具有显著的增效、减毒作用。Wei等[43]在肝药代谢酶对附子、防风配伍减毒机制的研究中发现,附子配伍防风能够诱导CYP3A4酶活性,增加CYP450酶含量,进而加快附子中双酯型二萜生物碱的肝脏代谢速度,减少其在体内的蓄积,达到减毒的效果。《三因极一病证方论》有附子绿豆汤的记载,以附子、绿豆配伍治疗寒客肌肤、腹大身肿之肤胀,其机理可能是绿豆中含有的鞣质和黄酮类化合物使乌头碱成分沉淀,不易被肠道吸收,但其代谢机制需进一步实验证实。研究表明,运用不同药物性味之间的相互克制,可以达到减毒、增效、扩大治疗范围的目的。

3.2 炮制减毒传统医学对于有毒药物的减毒方法,除配伍解毒外,还有炮制解毒、控制用药剂量等。贺亚男等[48]运用微波技术炮制附子并对其药效进行评估,发现微波技术可使附子双酯型生物碱水解,而其具有药理作用的有效成分没有减少,说明微波炮附子具有毒性低、质量稳定等优点。魏旭雅等[49]在乌头类炮制减毒的研究中发现,附子、川乌经过黑曲霉素发酵后,其乌头碱、次乌头碱等有毒成分显著降低,说明霉菌发酵亦可达到炮制减毒的效果,但其作用机制有待深究。临床常用附子久泡、久煎以达到减毒效果,夏飞等[50]研究发现,浸润时间对蒸附片单酯型生物碱成分含量的影响总体呈下降趋势,分别浸泡5 h、15 h、20 h,其单酯型生物碱含量依次为0.025 3%、0.025 5%、0.019 3%;同理,给予不同蒸制时间,发现无胆蒸附片中的单酯类生物碱成分亦随蒸制时间的延长而减少;在浸泡干燥生附片的用水量为1 g0.4 mL、蒸制温度为120 ℃、蒸制时间为50 min、干燥温度为100 ℃的条件下,所得蒸制附片中单酯类生物碱含量达0.308 5%,双酯型生物碱含量减少至0.014 8%,此时附子中单酯、双酯类生物碱含量最低,表明无胆蒸附片对二苯代苦味酰肼、羟基自由基以及超氧阴离子清除率具有一定的效果,可降低附子毒性。炮制解毒是有毒中药减毒的常用手段,通过物理、化学等炮制技术使药物的有效成分发生变化,以达到预期效果。

4 展望

本述评主要总结了附子中研究较少的有机生物碱的药理、毒理作用机制,乌头中含有乌头碱、次乌头碱和美沙乌头碱等几十种有机碱,其药理作用包括保护心脏、调节血糖、免疫及神经、抗肿瘤、抗炎、镇痛等。研究发现,有些化学成分对部分疾病的治疗独具优势,如去甲诸毛菜碱可增加去甲肾上腺素,影响突触可塑性,提高学习、认知能力,治疗智力发育障碍有很大的潜力;乌头碱的神经保护作用亦具有开发、推广的价值。但乌头碱的毒性不可忽视,其毒理作用主要包括心脏毒性,神经毒性,肝、肾毒性,胚胎、生殖毒性等,如乌头碱的心脏毒性能够影响细胞内电解质的紊乱,诱发恶性心律失常,传导阻滞,同时乌头碱毒素还可能损害中枢神经系统,从而导致大脑暂时或长期紊乱,因此应用时需要经过炮制、配伍以达到解毒、增效、扩大治疗范围的目的。

附子生物碱及其他成分的毒理效应大大影响了其临床应用,故今后需对附子有机生物碱进一步研究,以期发现低毒成分应用于临床。现有研究还有以下不足之处:对附子多糖的镇痛作用研究较少,虽已知附子多糖提取物尼奥灵对病理性神经痛有一定的疗效,但研究较为匮乏,其镇痛机制尚未明确;对酚类、醇胺类等附子有效成分的研究不足;对部分中药配伍解毒机制的研究仅限于理论探讨,有待加强实验验证;附子炮制过程中的分子变化机制尚未明确,需进一步研究其有效成分及分子作用,为临床应用提供参考。