李玉蝶，李玟君，汪海燕，宋青云，庞子皓，肖一郎，汪 超，李 玮

（湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北省食品发酵工程技术研究中心，湖北 武汉 430060）

花生蛋白是优质的可食用植物蛋白源[1]，其营养价值与动物蛋白相近。我国对食物蛋白研究相对滞后，尤其在花生蛋白产品制备工艺及其功能性研究方面起步较晚，大部分花生蛋白产品只能在低端市场徘徊，无法与国外产品形成竞争优势。因此，有必要改善花生蛋白的功能特性，弥补花生蛋白功能性的欠缺，进一步拓宽花生蛋白在食品工业上的应用。

花生蛋白经过碱溶酸沉或超滤膜法等制得的高纯度产品即为花生分离蛋白（peanut protein isolate，PPI），蛋白含量较高。花生蛋白由90%的盐溶性蛋白和10%的水溶性蛋白组成，而盐溶蛋白中则含有75%的花生球蛋白（14S）、25%的伴花生球蛋白（7.8S和2S）[2]。其中，花生球蛋白由3 个酸性亚基和3 个碱性亚基组成，具有紧密的球状结构，活性基团包裹于分子内部，伴花生球蛋白仅有一个亚基[3]。花生蛋白的结构变化影响花生蛋白的功能特性，尤其是盐溶性的球蛋白和伴球蛋白，二者的结构直接影响花生蛋白的热聚集和凝胶特性。目前，花生蛋白组分改性研究主要集中在超声波及酶处理等复合手段[4]，与传统方法相比，微生物发酵法更温和、廉价、安全和环保，特别是功能型益生菌。戊糖乳杆菌（Lactiplantibacillus pentosus）作为优质乳酸菌，可发酵高产乳酸及更多的酶系来水解蛋白，改善发酵微环境，赋予花生蛋白更好的营养与风味[5-6]，极具应用潜力。

本研究通过戊糖乳杆菌对提取出的PPI、花生球蛋白、伴花生球蛋白进行发酵处理，对比发酵处理前后花生不同组织蛋白分子结构、微观结构及热特性的变化规律，以期为研究乳酸菌改善花生蛋白聚集行为提高花生蛋白产品在蛋白基料中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

戊糖乳杆菌由实验室从鱼肉中自行分离，经16S rRNA鉴定为戊糖乳杆菌，于－80 ℃、含50%甘油冻存管中保存；低温脱脂花生粕 青岛长寿食品有限公司。

MRS液体培养基（蛋白胨1%、酵母粉0.5%、柠檬酸氢二铵0.2%、葡萄糖2%、乙酸钠0.3%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸镁0.058%、硫酸锰0.025%、牛肉膏1%、吐温800.1%）；其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MLS-3781L-PC高压蒸汽灭菌锅 上海医疗核子仪器厂；CR21N高速冷冻离心机、F-7000荧光分光光谱仪日本日立公司；ZWYR-D2403恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；ZLGJ-12真空冷冻干燥机郑州科旺达生物仪器有限公司；Nano ZS＋MPT-2纳米粒径及电位分析仪 英国Malvern公司；Vertex 70傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectrometer，FTIR）仪 德国Bruker公司；DSC1差示扫描量热仪（differential scanning calorimeter，DSC）瑞士Mettler-Toledo公司；JSM-6390LV扫描电子显微镜 日本电子公司。

1.3 方法

1.3.1 原料制备

PPI的制备方法参考丁玲等[7]的方法，将低温脱脂花生粕与0.02 mol/L pH 8.5的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）按质量比1∶10混合。60 ℃搅拌2 h，4 000 r/min离心20 min，取上清液用1 mol/L HCl溶液调至pH 4.5，静置30 min后再次离心（4 000 r/min、20 min），收集沉淀。加蒸馏水复溶后用1 mol/L NaOH溶液调节pH值到7.0，在4 ℃透析48 h，冷冻干燥后于4 ℃冰箱保存备用。花生球蛋白、伴球蛋白的制备参考封小龙[8]的方法略有改动，将制得的PPI溶于pH 7.10.4 mol/L磷酸缓冲溶液中（料液比为1∶10），常温搅拌混匀1 h后，8 000 r/min离心30 min，取上清液置于4 ℃冰箱冷沉4 h，然后在4 ℃、8 000 r/min离心30 min。沉淀经冷冻干燥得花生球蛋白，上清液调节pH值至4.5，4 500 r/min离心20 min后取沉淀冷冻干燥得伴花生球蛋白，4 ℃保存备用。

向各组发酵原料（蛋白与无菌水质量比为1∶14，pH 6.3）中接入2.5%的戊糖乳杆菌，置于35 ℃摇床200 r/min密闭发酵48 h；分别取发酵后PPI发酵液、花生球蛋白发酵液、伴花生球蛋白发酵液8 000 r/min离心20 min后，收集上清液，真空冷冻干燥，得到发酵后的PPI（FPPI）、花生球蛋白、伴花生球蛋白，4 ℃保存备用。

1.3.2 蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法测定各蛋白组分的含量。根据发酵前后蛋白组分质量差的百分比计算蛋白损失率。

1.3.3 游离巯基含量测定

参照Beveridge等[9]的方法略有改进，分别称取60 mg样品溶于10 mL Tris-Gly标准缓冲溶液中（pH 8.0），涡旋混匀后在25 ℃水浴条件下反应1 h，室温4 500 r/min离心15 min。取2 mL上清液于试管中，向其中加入50 μL Ellman试剂，涡旋混匀后室温静置反应5 min，通过紫外-可见分光光度计于412 nm波长处测定样品溶液吸光度A412nm。用试剂缓冲液作空白对照，按下式计算游离巯基含量：

式中：C为样品溶液质量浓度/（mg/mL）。

1.3.4 Zeta电位及平均粒径测定

参考Pi Xiaowen等[10]方法，称取0.01 mg样品溶解于1 L 0.01 mol/L pH 7的PBS中，溶液过0.45 μm水性滤膜后，使用纳米粒度及电位分析仪测定粒径分布和Zeta电位，测定温度25 ℃。

1.3.5 FTIR分析

参考耿军凤等[11]方法并略作修改，选用衰减全反射（attenuated total reflection，ATR）附件，取适量冻干样品薄片置于ATR附件上扫描，设定参数为扫描次数32，扫描范围4 000～500 cm－1，分辨率为4 cm－1。α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲对应谱带的波数范围分别为1 650～1 660、1 610～1 640、1 660～1 700 cm－1和1 640～1 650 cm－1。各二级结构相对含量通过相应峰的面积计算。

1.3.6 表面疏水性测定

根据贾润红[12]方法并稍作修改，分别用PBS（0.01 mol/L、pH 7.0）配制质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL的蛋白溶液4.0 mL，加入20 μL 8 mmol/L的1-苯胺基-8-萘磺酸溶液（pH 7.4）混匀后迅速使用荧光分光光度计进行测定。激发波长为390 nm，扫描发散光谱范围为450～650 nm，加速电压为600 V，狭缝宽度5 nm。以蛋白质量浓度对荧光强度作图，直线的斜率即为蛋白质的表面疏水性。

1.3.7 荧光光谱测定

参考廖钰等[13]方法并稍作修改，用pH 70.01 mol/L PBS配制质量浓度为1 mg/mL的蛋白溶液，在25 ℃使用荧光分光光度计对溶液进行光谱扫描，使用光程为1 cm的石英比色皿，测试条件：激发波长290 nm，扫描发散光谱范围300～400 nm，狭缝宽度5 nm，扫描速率1 200 nm/min。

1.3.8 扫描电子显微镜观察

将样品粘贴到干净的样品台上，对样品进行真空喷金镀膜处理后用扫描电子显微镜观察，放大倍数为1 000 倍。

1.3.9 热特性测定

参考严永红等[14]方法并稍作修改，采用DSC测定。取4 mg样品于样品盘中密封，以空坩埚作为空白对照，设定升温速率10 ℃/min，扫描间隔25～150 ℃。采用TA-60WS软件读取DSC谱图中花生蛋白样品的变性温度（Td）和总变性焓（ΔH）。

1.4 数据处理与分析

每个处理组进行3 次平行实验。采用Origin 9.6、Excel 2019和SPSS 25.0等软件对实验数据进行处理，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 花生粕蛋白质含量及戊糖乳杆菌发酵后蛋白损失率

如表1 所示，花生粕中PPI 得率为（88.57±5.16）%，其中花生球蛋白质量分数为（46.74±2.09）%，伴花生球蛋白质量分数为（40.29±3.22）%，与杜寅等[15]的研究结果一致，证明蛋白的分离效果较好。比较发酵处理后各蛋白的损失率发现，花生球蛋白的损失率低于PPI和伴花生球蛋白，可能是由于戊糖乳杆菌发酵过程分泌乳酸同时产生了多种蛋白酶系，利用蛋白产生了更多的氨基酸及小分子蛋白肽。花生球蛋白活性基团被球状包埋减少了结合位点，表现出比伴花生球蛋白更强的稳定性[3]。

表1 花生粕中不同蛋白含量及发酵后蛋白含量的损失率Table 1 Contents of different protein components in peanut meal and their loss rates after fermentation

2.2 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分游离巯基含量的影响

如图1所示，戊糖乳杆菌发酵后花生球蛋白游离巯基含量较发酵前增加了79.83%，而PPI和伴花生球蛋白较发酵前分别降低48.46%和55.15%，且发酵后伴花生球蛋白游离巯基含量的减少量比PPI多6.69%。戊糖乳杆菌发酵处理后球蛋白内部亚基结构充分展开，包埋在分子内部的巯基更多地暴露到分子表面，从而导致蛋白游离巯基含量增加[16]。随着发酵微环境的改变，球蛋白内部基团更活跃，蛋白结构展开程度增大，而PPI、伴花生球蛋白发酵后游离巯基含量降低是由于在发酵过程中，新展开的蛋白界面不稳定，暴露出的巯基与氧气结合形成了二硫键，从而使表面巯基含量降低[17-18]。结果表明，发酵处理可在一定程度上促使花生蛋白空间构象发生改变，生成聚集体，蛋白质分子质量增加，形成凝胶网络。

图1 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分游离巯基含量的影响Fig.1 Effect of L.pentosus fermentation on free sulfhydryl contents of different peanut protein components

2.3 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分Zeta电位及平均粒径的影响

如表2所示，各花生蛋白样品的Zeta电位均为负值，是由于其pH值高于等电点，蛋白表面羧基发生解离[19]。与发酵前相比，发酵处理后PPI和伴花生球蛋白组分的Zeta电位绝对值分别下降了54.77%、51.75%。可能是由于发酵处理使蛋白质结构展开，部分去折叠后形成的聚集体阻碍了蛋白质羧基解离，促使更多内部带正电荷的氨基酸残基暴露，与蛋白质表面的负电荷中和[20]，蛋白间静电相互作用减弱，使花生蛋白组分的稳定性增加。

表2 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分Zeta电位及平均粒径的影响Table 2 Effect of L.pentosus fermentation on zeta potential and average particle size of different peanut protein components

如表2和图2所示，发酵处理后不同花生蛋白组分的粒径峰值均向右移动，与发酵前相比，发酵后PPI、花生球蛋白、伴花生球蛋白平均粒径分别增加了16.91%、74.62%、52.46%，这可能是由于发酵处理增强了蛋白质分子间的相互作用，使蛋白质分子发生聚集。已有研究表明，蛋白分子平均粒径增大会增加分子表面积，在凝胶形成过程中可能有利于蛋白分子的聚集，从而提高凝胶的强度[21]，故发酵处理产生的分子聚集现象对各花生蛋白组分的凝胶特性具有积极影响。

图2 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分粒径分布的影响Fig.2 Effect of L.pentosus fermentation on particle size distribution of different peanut protein components

2.4 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分二级结构的影响

如图3所示，发酵处理后各花生蛋白组分FTIR光谱中特征峰位置均发生偏移，且峰强度也有所增加，说明发酵处理改变了各花生蛋白二级结构。如图4所示，与发酵前相比，戊糖乳杆菌发酵后PPI、花生球蛋白、伴花生球蛋白β-折叠相对含量分别降低了15.42%、5.41%、5.31%；PPI、伴花生球蛋白α-螺旋相对含量分别增加了12.23%、8.15%，花生球蛋白α-螺旋相对含量降低了3.35%。PPI和花生球蛋白发酵后β-转角和无规卷曲相对含量均增加，花生伴球蛋白无明显变化；这表明发酵处理可能使各花生蛋白组分由β-折叠转化为β-转角、α-螺旋和无规卷曲，蛋白分子从有序逐渐变为无序，蛋白原始构象展开。这可能是由于戊糖乳杆菌发酵过程中维系二级结构的作用力氢键被破坏，导致蛋白变性以及随后的聚集[22]。

图3 发酵前后不同花生蛋白组分FTIR光谱变化Fig.3 Changes in FTIR spectra of different peanut protein components before and after fermentation

图4 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分二级结构的影响Fig.4 Effect of L.pentosus fermentation on the secondary structures of different peanut protein components

2.5 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分表面疏水性的影响

蛋白质的表面疏水性主要取决于蛋白的去折叠程度及疏水基团的暴露程度[23]。如图5所示，与发酵前相比，发酵处理后的花生球蛋白表面疏水性增加了63.19%，而PPI、伴花生球蛋白表面疏水性分别降低了83.30%、80.66%。花生球蛋白表面疏水性的增加可能是由于戊糖乳杆菌发酵使球蛋白分子在发酵过程中结构展开，内部更多疏水基团发生暴露；PPI及伴花生球蛋白表面疏水性降低是由于在发酵过程中，展开的蛋白质分子又在疏水相互作用和二硫键作用下通过共价交联形成聚集体，掩埋了部分疏水基团，使蛋白表面疏水性降低[24-25]。与花生球蛋白及伴花生球蛋白相比，PPI表面疏水性降低幅度最大，可见PPI分子间重折叠发生了更多的交联反应。综上，戊糖乳杆菌发酵处理可以促进花生蛋白分子间亲水相互作用，疏水性相互作用减弱，大量水分结合到蛋白表面。

图5 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分表面疏水性的影响Fig.5 Effect of L.pentosus fermentation on the surface hydrophobicity of different peanut protein components

2.6 戊糖乳杆菌发酵前后不同花生蛋白组分荧光光谱变化

如图6所示，发酵前PPI、花生球蛋白、伴花生球蛋白最大发射波长（λmax）分别为（342.1±0.71）、（330.3±0.14）、（340.4±0.57）nm，戊糖乳杆菌发酵后三者λmax分别为（354.9±0.42）、（344.4±0.00）、（352.1±0.42）nm，结果表明，发酵处理后各花生蛋白组分λmax均发生红移，蛋白结构展开，更多的Trp/Tyr残基和疏水基团暴露在溶剂中，增加了微环境的非极性。与PPI及伴花生球蛋白相比，花生球蛋白红移幅度分别增大1.3 nm和2.4 nm，说明花生球蛋白分子构象的变化程度最大[26]；此外，发酵处理后各花生蛋白组分的荧光强度均显著降低，可能是由于发酵过程中戊糖乳杆菌与花生蛋白分子间相互作用增强，诱导蛋白质肽链重新折叠卷曲，使发酵后各组分花生蛋白发生聚集导致荧光猝灭现象产生[27-28]。其中，发酵PPI的荧光强度最低，分子间碰撞产生更多交联反应，引起更多的荧光猝灭，这与表面疏水性的结果一致。

图6 发酵前后不同花生蛋白组分荧光光谱的变化Fig.6 Changes in fluorescence spectra of different peanut protein components before and after fermentation

2.7 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分微观结构的影响

如图7所示，发酵前花生蛋白大都呈球形颗粒状[29]；发酵后各花生蛋白组分结构形态明显改变，球形结构被破坏，蛋白分子呈现扁平状，可见多层蛋白质堆叠与聚集，样品呈碎片化和断裂，蛋白空间构象发生改变。这可能是由于发酵过程中，各组分花生蛋白受到戊糖乳杆菌发酵的影响，蛋白结构展开并发生分子间交联所致。

图7 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分微观结构的影响Fig.7 Effect of L.pentosus fermentation on the microstructure of different peanut protein components

2.8 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分热特性的影响

如图8和表3所示，戊糖乳杆菌发酵处理对各花生蛋白热稳定性的影响具有明显差异。与发酵前相比，戊糖乳杆菌发酵处理后PPI的Td升高了4.36 ℃，花生球蛋白Td升高了17.83 ℃，伴花生球蛋白Td升高了7.31 ℃，结果表明发酵处理可增加各组分花生蛋白的热稳定性，其中发酵后的花生球蛋白比PPI、伴花生球蛋白Td增幅大19.54%、14.75%，表明花生球蛋白Td增幅最大，热稳定性受到的影响最为显著。发酵前Td：PPI＞花生球蛋白＞伴花生球蛋白；发酵处理后Td：花生球蛋白＞PPI＞伴花生球蛋白，说明伴花生球蛋白对热最敏感，花生球蛋白的热稳定性比伴花生球蛋白好，此研究与杜寅[30]的研究结果一致。如表3所示，发酵后各花生蛋白ΔH为负值，呈降低趋势，说明发酵处理后花生蛋白分子间作用力增加，聚集程度增加，与粒径结果研究一致。

图8 戊糖乳杆菌发酵对不同花生蛋白组分热特性的影响Fig.8 Effect of L.pentosus fermentation on the thermal properties of different peanut protein components

表3 发酵前后不同花生蛋白组分的Td及ΔHTable 3 Td and ΔH of different peanut protein components before and after fermentation

3 结论

戊糖乳杆菌发酵可显著提升花生球蛋白、降低PPI与伴花生球蛋白的游离巯基含量、表面疏水性。发酵后伴花生球蛋白游离巯基含量的减少量比PPI多6.69%，花生球蛋白游离巯基含量的提升有利于热凝胶的形成，在花生蛋白替代动物蛋白形成凝胶产品的应用方面具有促进作用。发酵后各花生蛋白组分的粒径和Zeta电位值显著提升，蛋白荧光λmax红移，表明花生蛋白的聚集发生改变，与PPI、伴花生球蛋白相比，花生球蛋白荧光扫描λmax红移幅度超过1.3 nm和2.4 nm。证明花生球蛋白比PPI、伴花生球蛋白的链长更易发生延展效应，在蛋白修饰方面更具潜力。结合热特性和扫描电子显微镜分析发现花生球蛋白在发酵后结构展开程度最大、热稳定性更高，发酵后的花生球蛋白比PPI、伴花生球蛋白Td增幅大19.54%、14.75%，证明戊糖乳杆菌更易促进花生球蛋白的分子改性，并对花生蛋白的凝胶改性起到良好的促进作用。