沈嘉铭 陶云珍 刘长鹏 冯 爽 王运中 薛 建张优仪 赵根明，3 邵雪君 张 涛，3△

（1复旦大学公共卫生学院流行病学教研室/公共卫生安全教育部重点实验室 上海 200032；2苏州大学附属儿童医院检验科 苏州 215003； 3上海市重大传染病和生物安全研究院 上海 200032）

侵袭性肺炎链球菌性疾病（invasive pneumococcal disease，IPD）指从正常无菌部位（如血、脑脊液、胸腹水或关节腔积液等）分离到肺炎链球菌的感染性疾病，如脑膜炎、胸膜炎、菌血症和菌血症性肺炎等［1］。IPD 在儿童中发病率和病死率均较高［2］，且机体健康状况、抗菌药物的使用情况、地区所流行的血清型等因素也会影响其发生率［3］。据估计，我国每100 万名5 岁以下儿童中约有30 000 例死于IPD，疾病负担严重［4］。肺炎球菌结合疫苗（13-valent pneumococcal conjugate vaccine，PCV13）是预防侵袭性肺炎链球菌感染的重要手段［5］。研究显示，在欧美等将PCV 疫苗纳入国家免疫计划的国家，儿童PCV 疫苗的广泛接种大幅降低了疫苗血清型引起的IPD 发病，但非疫苗血清型的占比逐渐升高，即血清型替换现象。PCV13 于2016 年11 月在我国作为二类疫苗获批上市，各地区的接种率有所不同，在当前的免疫策略下PCV13 接种是否会导致类似血清型替换现象尚不清楚。

苏州作为中国东部发达地区的代表城市之一，拥有繁荣的经济和优越的医疗条件，该地区的研究结果对华东地区及其他相似地区均具有较好参考价值。苏州大学附属儿童医院是苏州地区唯一一家三级甲等儿童专科医院，儿童住院总量占苏州市辖区的65.2%，选择该医院开展研究，具有良好的人群代表性。因此，为了解PCV13 引入前后侵袭性菌株对常见药物的敏感性和血清型分布的变化情况，本研究将分析2010—2020 年间从苏州大学附属儿童医院就诊患儿无菌部位标本分离的肺炎链球菌菌株的流行病学特征、血清型分布及抗菌药物敏感性情况，为儿童IPD 防治提供参考。

资 料 和 方 法

研究对象2010 年1 月—2020 年12 月期间就诊于苏州大学附属儿童医院患儿中，根据诊疗常规需要采集了正常无菌部位标本如血液、脑脊液、胸腔积液、关节积液等，且病原菌培养为肺炎链球菌阳性者均为本研究的对象。患儿的人口学信息及菌株抗菌药物药敏结果，包括性别、年龄、就诊时间、出院诊断等，通过查阅病历进行回顾性收集。本研究获得复旦大学公共卫生学院伦理委员会批准（批准号：IRB#2017-11-0646）。

菌株来源系统收集研究期间从患儿无菌部位标本分离的肺炎链球菌菌株，并剔除从同一个患儿中分离的重复菌株。肺炎链球菌的判定标准为：（1）菌落特点：α 溶血，菌落中心凹陷呈“脐状”；（2）奥普托欣实验敏感；（3）胆汁溶菌试验阳性［6］。分离的菌株用MicrobankTM磁珠冻存于-80 ℃冰箱，定期转运至复旦大学公共卫生安全教育部重点实验室完成菌株的复苏及血清分型。

药敏试验菌株药敏试验由苏州大学附属儿童医院检验科在患儿住院期间完成。通过 Kirby-Bauer 纸片扩散法测定肺炎链球菌菌株对利福平的敏感性，采用E-test 法测定红霉素、克林霉素、四环素、复方新诺明、喹奴普丁/达福普汀、青霉素G、头孢噻肟、氯霉素、阿莫西林、万古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺对肺炎链球菌菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。 Kirby-Bauer 纸片扩散法及E-test 法药敏纸片和MH 琼脂平板均购自英国OXOID 公司。药敏试验结果按照临床实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准进行判定［7］。将肺炎链球菌ATCC49619 作为质控菌株。

血清分型将菌株从-80 ℃冰箱中取出，接种于哥伦比亚血琼脂培养基上进行复苏培养，成功复苏的菌株使用乳胶凝集试剂盒进行初筛确定血清群，然后进行荚膜肿胀反应明确菌株的血清型。血清分型试剂（Pneumococcus Pool Antisera 和Pneumococcus Factor Serum）均购自丹麦国家血清研究所。

统计学分析应用SPSS26.0 软件进行数据的统计分析。采用聚类分析将菌株对抗菌药物的敏感性分类。采用χ2检验或Fisher 确切概率法比较不同标本来源（脑脊液和血液等）、不同时间（2010—2016 年与2017—2020 年）分离的肺炎链球菌耐药性、血清型及临床特点差异，并比较青霉素敏感菌株（penicillin-susceptiblestreptococcus pneumoniae，PSSP）和青霉素不敏感菌株（penicillin nonsusceptiblestreptococcal pneumoniae，PNSP）对其他β-内酰胺类抗菌药物的敏感性及其与血清型的关联。双侧P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

菌株基本信息2010—2020 年从就诊患儿无菌部位标本中共分离到215 株肺炎链球菌，分别为脑脊液61 株（28.4%）、血液139 株（64.7%）和胸水15 株（7.0%）。其中135株（62.8%）分离自2010—2016 年，80 株（37.2%）来自2017—2020 年。126 株（58.6%）来自男性患儿，89 株（41.4%）来自女性患儿。83.3%的菌株（179 株）分离自5 岁以下儿童。这215 名侵袭性肺炎链球菌疾病患儿中，55 例（25.6%）被诊断为脑膜炎（pneumococcal meningitis，PM）、160 例（74.4%）属于血流感染。秋冬季发病者最多（秋季、冬季各占30.7%），春季次之（27.9%）。

药敏试验结果本研究收集的215 株肺炎链球菌菌株中，97%以上菌株对红霉素和克林霉素耐药，未检测到对万古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺耐药的菌株（表1）。

表1 2010—2020 年苏州地区儿童侵袭性肺炎链球菌药敏试验结果Tab 1 Results of antimicrobial susceptibility testing for invasive Streptococcus pneumoniae isolated from children in Suzhou from 2010 to 2020

根据菌株的耐药特点，共发现30 种耐药模式，仅有1 株（0.5%）分离株对13 种抗菌药物均表现敏感，1 株（0.5%）仅对一类抗菌药物（复方新诺明）耐药，1 株（0.5%）对两类抗菌药物（红霉素+克林霉素）耐药，98.6%（212/215）的分离株均为多重耐药。其中，最主要的耐药模式为：红霉素+克林霉素+四环素+复方新诺明+喹奴普汀+β-内酰胺类抗菌药物，占所有分离株的28.4%。

相比脑膜炎分离株，血流感染分离株对头孢噻肟（39.4%vs.67.4%）和青霉素（28.2%vs.58.5%）的不敏感率更低，差异有统计学意义（均为P＜0.001）。而血流感染分离株对喹奴普汀的不敏感率高于脑膜炎分离株（74.0%vs.63.0%），但差异无统计学意义（χ2=2.4，P=0.123）。

与2010—2016 年分离株相比，2017—2020 年分离株对复方新诺明和头孢噻肟的不敏感率显著下降（76.3%vs.88.9%；35.0%vs.53.3%），且差异具有统计学意义（χ2=6.0，P=0.014；χ2=6.8，P=0.009）；而对喹奴普丁/达福普汀的不敏感率有所上升（75.6%vs.68.5%），但差异无统计学意义（χ2=1.2，P=0.269），详见图1。

图1 2010—2016 年与2017—2020 年肺炎链球菌分离株的耐药情况Fig 1 Results of antimicrobial susceptibility testing for invasive Streptococcus pneumoniae between 2010-2016 and 2017-2020

血清型分布由于部分菌株丢失等原因，本研究成功复苏并检测了133 株（61.9%）菌株的血清型，其中包括85.5%脑膜炎病例分离株和53.8%的血流感染分离株。共检出11 种血清型，其中最常见血清型为6B（21.8%），其次为14（21.1%）、19F（16.5%）、19A（15.8%）和23F（11.3%）。PCV7、PCV13 疫苗血清型覆盖率分别为75.9%和93.2%。

血流感染病例分离株与脑膜炎病例分离株的血清型分布差异有统计学意义（χ2=33.1，P＜0.001），脑膜炎病例分离株中血清型6B（29.8%vs.17.4%，χ2=2.04，P=0.153）和14（25.5%vs.18.6%，χ2=0.51，P=0.475）占比高于血流感染病例分离株，而血清型19F占比低于血流感染病例分离株（8.5%vs.20.9%，χ2=2.56，P=0.110），但差异无统计学意义（表2）。

表2 2010—2020 年苏州地区儿童侵袭性肺炎链球菌血清型分布Tab 2 Serotype distribution of invasive Streptococcus pneumoniae isolated from children in Suzhou from 2010 to 2020 ［n（%）］

不同年份分离株的血清型分布差异有统计学意义（χ2=37.8，P＜0.001），与2010—2016 年分离株相比，血清型6B（25.9%vs.0，χ2=5.52，P=0.019）和14（24.1%vs.4.8%，χ2=2.90，P=0.088）的占比在2017 年后显著下降，而19F（13.4%vs.33.3%，χ2=3.75，P=0.053）和23F（7.1%vs.33.3%，χ2=9.65，P=0.002）却显著上升，且在2017 年后出现了非疫苗血清型6D（表2）。

菌株对青霉素的敏感性及其与血清型的关联本研究的肺炎链球菌分离株对青霉素G 的总体不敏感率为35.9%，其中脑膜炎分离株的不敏感率为58.5%，血流感染分离株的不敏感率为28.2%。青霉素不敏感菌株对其他β-内酰胺类抗菌药物的不敏感率显著高于青霉素敏感菌株，如阿莫西林（PNSPvs.PSSP：52.5%vs.16.7%，χ2=36.4，P＜0.001）和头孢噻肟（PNSPvs.PSSP：88.0%vs.23.9%，χ2=92.9，P＜0.001）。

此外，PNSP 菌株中血清型19A、19F 和23F 的比例均高于PSSP 菌株，分别为24.5%vs.10.8%、20.4%vs.14.5% 和12.2%vs.10.8%。而PSSP 菌株中血清型6B 菌株所占的比例（25.3%）高于PNSP菌株（16.3%）。在PNSP 和PSSP 菌株中PCV13 疫苗血清型菌株所占比例分别为95.9%和91.6%，差异无统计学意义。

讨 论

侵袭性肺炎链球菌性疾病一般可分为肺炎链球菌血流感染及肺炎链球菌脑膜炎，常见于儿童、老年人及免疫缺陷患者［1］。本研究分析了苏州大学附属儿童医院2010 年1 月—2020 年12 月分离的215株侵袭性肺炎链球菌，发现PNSP 菌株检出率为35.9%，常见血清型为6B、14、19F、19A 和23F，PCV13 疫苗血清型覆盖率为93.2%。本研究中IPD患儿多为5 岁以下儿童（83.3%），以血流感染为主（74.4%），与国内外报道一致［8-9］。

本研究发现肺炎链球菌侵袭株对红霉素、克林霉素耐药率高达97%以上，而对万古霉素、左氧氟沙星和利奈唑胺全部敏感，对氯霉素和利福平也高度敏感，与国内研究相似［10］。这可能与大环内酯类抗菌药物在国内儿科中的大量使用有关，而万古霉素并非临床治疗社区获得性感染一线药物，所受抗菌药物压力较小而较少发生耐药。本研究发现2017 年后分离株对多种抗菌药物不敏感率较前有所下降，其中对复方新诺明、头孢噻肟的不敏感率下降显著，可能与近年来抗菌药物的规范使用有关。同时，国外研究显示，PCV 疫苗的广泛接种在解决肺炎链球菌抗菌药物耐药性方面可能发挥重要作用［11］，但由于苏州地区疫苗接种率较低，尚不清楚是否是由于PCV 疫苗的接种而引起抗菌药物耐药性的变化。

青霉素曾是治疗肺炎链球菌感染的标准抗菌药物，但目前肺炎链球菌对青霉素的耐药情况日趋严重。本研究中，肺炎链球菌侵袭株对青霉素的不敏感率为35.9%，其中脑膜炎菌株不敏感率为58.5%，非脑膜炎菌株不敏感率为28.2%，远高于苏州地区2017—2019 年儿童NIPD 分离株10.0%的不敏感率［12］。而在一项全国多中心研究中，2012—2017 年儿童侵袭性肺炎链球菌中脑膜炎和非脑膜炎菌株对青霉素的不敏感率分别为69.5% 和35.9%［13］，高于本研究，可能与不同地区抗菌药物使用情况及流行菌株差异有关。脑膜炎菌株对青霉素的不敏感率更高可能是由于两种菌株判断标准不同所致，对于PM 患者，采用青霉素治疗时使用更大剂量，因此CLSI 判定标准中，非PM 菌株青霉素MIC≤2 μg/mL 即为敏感，而PM 菌株青霉素MIC≤0.06 μg/mL 方为敏感［7］。多项研究显示，抗菌药物耐药性与肺炎链球菌菌株血清型间有一定相关性［14-15］，其中19A、19F 及23F 菌株与抗菌药物高耐药性密切相关，与本研究结果一致。本研究中PNSP 对其他β-内酰胺类抗菌药物不敏感率显著高于PSSP，PNSP 相比PSSP 对复方新诺明的不敏感率也更高，且多重耐药率高达98.6%，可见抗菌药物间交叉耐药及多重耐药问题需加以重视。

研究显示，有限数量的血清型导致了全球大部分5 岁以下儿童IPD 的发生，其中血清型1、5、6A、6B、14、19F 和23F 为最主要的7 种血清型，但不同地区间仍存在很大差异［16］。本研究最常见血清型为6B（21.8%）、14（21.1%）、19F（16.5%）、19A（15.8%）和23F（11.3%），与我国一项多中心研究［17］及深圳一项研究［18］中儿童IPD 血清型前五位一致，仅排序略有不同，但与国外常见血清型差异较大。如在印度，导致儿童IPD 的主要血清型为1、6B 和14［15］。研究显示，欧洲多国引起儿童IPD 最常见的血清型为14、6B、19F 和23F，但PCV7 广泛使用后，PCV7 血清型占比显著下降，而非PCV7 血清型1、19A、3、6A/C 和7F 正逐渐增多［11］。由于苏州地区疫苗接种率较低，本研究中未观察到类似的血清型替代现象。值得关注的是，在2016 年底PCV13 引入后，疫苗血清型19F 和23F 的占比反呈上升趋势，可能与这两种血清型菌株耐药率高，因而在疫苗接种率较低的情况下减少不明显有关，而其他疫苗血清型如6B、14 的占比显著下降，使得19F 和23F 的占比相对上升；此外，也可能是样本量相对较少导致结果不稳定所致。但自2017 起，我们观察到了非疫苗血清型分离株（6D）的出现，提示今后应持续开展监测以了解菌株血清型的变化趋势。本研究中PCV7、PCV13 疫苗分别可覆盖检出IPD 血清型的75.9% 和93.2%，高于苏州地区NIPD 菌株的PCV13 疫苗血清型覆盖率（73.1%）［9］，与国内研究相似［19］。

本研究也存在一些局限性。首先，所有菌株仅来自一家医院，样本量相对较小，结果的代表性和稳定性可能会受到影响，今后可继续监测并扩大研究范围。其次，由于部分患儿非苏州户籍，难以获得其免疫接种信息，因此本研究未能综合考虑患儿肺炎球菌疫苗接种情况。为了更全面地了解疫苗的效果，未来可以纳入患儿的疫苗接种情况进行分析。

综上所述，苏州地区儿童侵袭性肺炎链球菌血清型主要为6B、14、19F、19A 和23F，PCV13 疫苗可有效覆盖。抗菌药物耐药问题仍不容忽视，有必要持续监测，同时加强临床合理用药，以控制抗菌药物耐药情况。

作者贡献声明沈嘉铭 论文构思和撰写，数据统计和分析，实验操作。陶云珍，王运中，薛建，邵雪君 数据收集。刘长鹏，冯爽，张优仪 实验操作。赵根明 论文修订。张涛 论文构思、撰写和修订，数据统计和分析。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。