朱 琳 蒯 铮 宋 乐 胡 予 沈锡中 张丹瑛△

（1复旦大学附属中山医院老年病科， 2消化科 上海 200032）

微生物在宿主动脉粥样硬化的发生发展中发挥着重要作用。研究显示不同的病原微生物，如牙周病细菌、肺炎衣原体、幽门螺杆菌等，均与冠心病有一定的相关性［1-2］。一些动脉粥样硬化的患者尽管没有任何常见的高危因素，却仍然有高水平的斑块负担，而肠道菌群组成的差异或能解释其中的关联［3］。将促炎性肠道菌群引入具有类人脂蛋白特征的小鼠模型会增加全身炎症并加速动脉粥样硬化的形成，提示肠道菌群的组成、炎症和动脉粥样硬化之间存在因果关系［4］。

抗生素，尤其是肠道不可吸收的抗生素，可以改善慢性系统性炎症，但对冠心病人群进行抗生素治疗的研究均未获得临床有益结果［5-7］。益生菌是一种活性微生物补充剂，可通过调节肠道菌群的平衡对宿主产生有益的作用。研究显示益生菌可改善宿主脂代谢，调节炎症，减轻高脂饮食诱导的动脉粥样硬化［8-10］。益生菌也是肠道共生菌群的成员，外源性补充益生菌能调节宿主肠道微环境，改善动脉粥样硬化的发生发展。目前尚不清楚庞大的肠道共生菌群对宿主动脉粥样硬化的影响。考虑到动脉粥样硬化是一种慢性系统性炎症性疾病，在全面清除宿主肠道菌群的情况下，是否会影响动脉粥样硬化的发生发展，还需进一步研究和探讨。

研究显示，采用鸡尾酒式联合口服万古霉素、甲硝唑、硫酸新霉素及氨苄青霉素，可以清除宿主肠道内90%以上的共生微生物群［11-12］。本研究利用该四联抗生素分别对普通饲料及高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠进行干预，评估小鼠动脉粥样硬化斑块情况、炎症水平和肠道机械屏障功能的变化，以探索肠道共生菌对宿主动脉粥样硬化的影响，有助于未来建立肠道微生物-心血管轴通路，为代谢性及炎症性疾病的防治提供新的理论依据和治疗靶点。

材 料 和 方 法

动物实验ApoE-/-雌性小鼠（C57BL/6），SPF级，5 周龄，体质量16～20 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司［批准号：SYXK（京）2022-0052］，于复旦大学实验动物科学部SPF 级饲养，饲养温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%，自由进食和饮水。所有动物实验程序均符合实验动物福利伦理审查的规定和指导原则。

小鼠进入动物房后适应性喂养1 周，然后随机分为普通饲料组（NC 组）、普通饲料+四联抗生素组（NC-Abx 组）、高脂高胆固醇饲料（HF 组）和高脂高胆固醇饲料+四联抗生素组（HF-Abx 组）。每组分2 笼，每笼饲养5 只小鼠。饲料由南通特洛菲饲料科技有限公司提供，经过辐照灭菌。普通饲料（TP26338）营养素比例：蛋白质19.4%，碳水化合物63.6%，脂肪17%，总热量3 724.7 kcal/kg。高脂高胆固醇饲料（TP26303）配方成分增加了无水奶油及胆固醇，胆固醇总含量为0.2%。高脂高胆固醇饲料营养素比例：蛋白质15.5%，碳水化合物42.5%，脂肪42%，总热量4 495 kcal/kg。抗生素均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，混合溶液的制备：万古霉素0.5 g/L，硫酸新霉素1 g/L，氨苄青霉素1 g/L，甲硝唑1 g/L，作为饮水干预，每2 天配置新鲜溶液。定期记录小鼠的进食量并计算每周小鼠的平均进食量，每2 周记录一次小鼠体重。干预周期为14 周，采集标本前一天晚上开始禁食，自由饮水。

动脉粥样硬化斑块分析小鼠主动脉全长及心脏一并取下，置于4%多聚甲醛中固定6 h，转移至20%蔗糖溶液中过夜，再转移到30%蔗糖溶液中长期保存。小鼠主动脉纵向剪开并清除周围脂肪后进行油红O 染色。主动脉面积及斑块面积为主动脉弓至髂动脉分支处，不计入头臂干动脉、左颈总动脉、左锁骨下动脉及其分支血管。主动脉弓定义为从主动脉弓起始处至左锁骨下动脉以下3 mm。用Image J 软件分析斑块面积占主动脉面积的比值。

血清生化及炎症指标检测摘除眼球取血，血液静置2 h，4 ℃下3 000×g离心15 min，分离血清。使用南京建成生物工程研究所试剂盒检测小鼠血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。通过ELISA 方法检测小鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）（加拿大Anogen 公司）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（德国Hyglos 公司）及IL-1β（美国R&D 公司）的水平。操作流程及质控均按照各试剂盒操作步骤进行。

实时PCR 检测从小鼠回肠、结肠组织中提取总RNA，测定浓度后进行反转录，通过实时PCR 方法分别测定肠上皮细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、ZO-1及Occludin 的mRNA 表达水平，内参为β-actin。使用动物组织总RNA 提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司，DP431）提取各组织中的总RNA。使用PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒（日本TaKaRa 公司，RR047A）对总RNA 进行反转录合成cDNA。使用TB Green ™Premix Ex Taq™ Ⅱ（日本TaKaRa 公司，RR820A）进行实时PCR 反应。使用ABI 7500 实时PCR 仪进行扩增，采用两步法进行PCR 反应：预变性95 ℃30 s，PCR 反应95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循环40 次；溶解曲线程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。PCR引物序列见表1。

表1 定量PCR 引物序列Tab 1 Sequences of the primers for quantitative real-time PCR

Western blot 检测从小鼠回肠及结肠组织中提取总蛋白，测定浓度后通过Western blot 方法分别测定紧密连接蛋白ZO-1 和闭合蛋白（occludin）的蛋白表达，内参为肌动蛋白（actin）。闭合蛋白相对分子质量＜90 000，转膜条件为4 ℃下60 V 持续1.5 h，ZO-1 （相对分子质量＞90 000）转膜条件为4 ℃下120 V 持续2 h。

免疫组化染色将小鼠回肠组织蜡块切成厚度为5 μm 石蜡切片，脱蜡后进行抗原修复并阻断内源性过氧化物酶。滴加PBS 稀释的一抗，阴性对照组织上滴加PBS，于4 ℃湿盒中孵育过夜（15 h）。ZO-1 稀释比为1∶250，闭合蛋白稀释比为1∶100。滴加二抗-过氧化物酶，37 ℃孵育30 min。PBS 冲洗后每张切片滴加新鲜配制的DAB 显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色。切片置于10×40 倍光镜下，每张切片随机选取5 个视野，Image-Pro Plus 6 图像分析软件检测阳性染色部位的积分光密度（integrated optical density，IOD）值，结果表示为IOD/目标分布区域面积（area）。

统计学分析近似正态分布的定量资料用±s表示。多组间样本均数比较采用ANOVA 进行检验。组间两两比较：符合方差齐性，采用Bonferroni法进行检验；方差不齐，采用Tamhane 法进行检验。应用IBM SPSS 19.0 软件进行统计分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

抗生素干预下小鼠摄食量和体质量的变化定期记录每组小鼠的摄食量和体质量，结果发现：HFAbx 组小鼠摄食量逐渐升高，从第8 周起与其他3 组小鼠的摄食量相比差异有统计学意义（P＜0.01，图1A）。NC 组与NC-Abx 组小鼠相比，在整个干预过程中摄食量无明显差异（图1A）。HF-Abx 组小鼠虽然摄食量明显增多，但体质量无明显增加；从第12 周起HF-Abx 组小鼠体质量明显低于HF 组（P＜0.05，图1B）。NC 组与NC-Abx 组小鼠相比，在整个干预过程中体质量无明显差异（图1B）。

图1 各组小鼠摄食量及体重Fig 1 Food intake and body weight of the mice in different groups

抗生素干预下小鼠动脉粥样硬化斑块的形成应用油红O 染色在小鼠主动脉大体标本中反映动脉粥样硬化斑块的形成情况（图2A、2B）。与NC 组相比，NC-Abx 组小鼠在主动脉弓处形成明显的动脉粥样硬化病变（图2A），且斑块面积占主动脉面积的百分比显著升高（NC 组：1.375%±0.225%，NCAbx 组：2.406%±0.187%，P=0.016）（图2B）。另一方面，HF-Abx 组小鼠的动脉粥样硬化病变比HF 组明显减少（HF 组：8.906%±0.901%，HF-Abx 组：5.976%±0.650%，P=0.040）（图2A、2B）。

图2 小鼠主动脉粥样硬化斑块的油红O 染色结果Fig 2 Oil-red-O staining results of atherosclerotic plaque in the mice

抗生素干预下小鼠脂代谢水平NC-Abx 小鼠的血清HDL-c 水平较NC 组明显升高［NC 组（0.718±0.148）mmol/L，NC-Abx 组（1.496±0.173）mmol/L，P＜0.001］（图3B），而在血清总胆固醇及甘油三酯水平上，两组差异无统计学意义（图3A、3C）。

图3 抗生素对各组小鼠脂代谢的影响Fig 3 The effect of antibiotics on lipid metabolism in the mice from different groups

HF-Abx 组小鼠的血清总胆固醇水平较HF 组明显下降［HF 组（34.20±4.17）mmol/L，HF-Abx 组（18.76±1.52）mmol/L，P＜0.001］（图3A），而在血清HDL-c 及甘油三酯水平上，两组差异无统计学意义（图3B、3C）。

抗生素干预下小鼠血清炎症因子水平NCAbx 组小鼠血清IL-1β 明显高于NC 组小鼠［NC 组（4.444±0.356）pg/mL，NC-Abx 组（11.42±1.079）pg/mL，P=0.005］及TNF-α 水平［NC 组（8.668±2.893）pg/mL，NC-Abx 组（20.69±1.15）pg/mL，P=0.021］（图4B、4C），但两组小鼠血清LPS 水平差异无统计学意义（P=0.560，图4A）。HF-Abx 小鼠血清LPS 水平［HF 组（2.943±0.133）EU/mL，HFAbx 组（2.175±0.136）EU/mL，P=0.0026］（图4A）和血清TNF-α 水平［HF 组（23.86±2.184 pg/mL，HF-Abx 组（13.52±2.895）pg/mL，P=0.029］（图4C）均显著低于HF 组，但两组血清IL-1β 水平差异无统计学意义（P=0.819，图4B）。

图4 抗生素对各组小鼠血清炎症水平的影响Fig 4 The effects of antibiotics on serum inflammation levels in the mice from different groups

抗生素干预下小鼠肠道组织炎症水平不同饲料喂养下，用四联抗生素清除肠道菌群，宿主的肠道炎症状态表现出不同的结果。普通饲料喂养下，清除肠道微生物后小鼠肠道组织表现出更高的炎症水平：与NC 组相比，NC-Abx 组小鼠回肠上皮IL-1β mRNA（P=0.003）和TNF- α mRNA（P=0.007）表达显著升高（图5A），IL-6 mRNA 表达略有升高，但差异无统计学意义（图5A）；NC-Abx 组小鼠结肠上皮TNF-α mRNA 表达显著升高（P=0.029，图5B），IL-6 mRNA 及IL-1β mRNA 表达有所升高，但差异无统计学意义（图5B）。

图5 抗生素对各组小鼠肠道组织炎症水平的影响Fig 5 Effects of antibiotics on inflammation levels in the intestinal tissues of mice from different groups

高脂饲料喂养下，小鼠肠上皮炎症因子表达水平高于普通饲料组：HF 组小鼠回肠上皮TNF-α mRNA（P=0.038）、IL-6 mRNA（P=0.04）和IL-1β mRNA（P=0.014）表达显著高于NC 组（图5A）。HF 组小鼠结肠上皮TNF-α mRNA（P=0.024）及IL-6 mRNA（P=0.001）表达显著高于NC 组，IL-1β mRNA 表达高于NC 组，但差异无统计学意义（图5B）。四联抗生素清除肠道微生物后，小鼠肠道组织的炎症水平明显下降：HF-Abx 组小鼠回肠及结肠上皮TNF-α mRNA（回肠：P=0.030，结肠：P=0.029）、IL-6 mRNA（回肠：P=0.04，结肠：P=0.001）和IL-1β mRNA（回肠：P=0.004，结肠：P=0.017）表达均明显低于HF 组（图5A、5B），差异有统计学意义。

抗生素干预下小鼠肠道组织紧密连接蛋白的表达普通饲料喂养下，用四联抗生素清除肠道微生物后小鼠肠道组织闭合蛋白和ZO-1 的mRNA 表达明显下降：与NC 组相比，NC-Abx 组小鼠回肠及结肠组织闭合蛋白mRNA（回肠：P=0.001，结肠：P=0.013）和ZO-1 mRNA（回肠：P=0.020，结肠：P=0.016）表达均明显下降（图6A、6B）；NC-Abx 组小鼠回肠及结肠组织闭合蛋白及ZO-1 的蛋白表达均明显下降（P＜0.001，图6C、6D）。

图6 抗生素对各组小鼠肠道组织紧密连接蛋白表达的影响Fig 6 Effects of antibiotics on the expression of tight-junction proteins in the intestinal tissues of mice from different groups

高脂饲料喂养下，小鼠肠上皮细胞紧密连接蛋白表达明显低于普通饲料组。HF 组小鼠回肠组织闭合蛋白mRNA（P=0.004）和ZO-1 mRNA（P=0.034）表达显著低于NC 组（图6A）；HF 组小鼠回肠组织的ZO-1 和闭合蛋白蛋白表达均显著低于NC组（P＜0.001，图6C）。HF 组小鼠结肠组织闭合蛋白mRNA 表达显著低于NC 组（P＜0.001，图6B），ZO-1 mRNA 表达低于NC 组小鼠，但差异无统计学意义（P=0.446，图6B）；HF 组小鼠结肠组织的ZO-1和闭合蛋白蛋白表达均显著低于NC 组（P＜0.001，图6D）。高脂饮食下四联抗生素清除肠道微生物后，小鼠肠道组织的紧密连接蛋白表达无显著变化：HF-Abx 组小鼠回肠及结肠组织闭合蛋白及ZO-1 的mRNA 表达与HF 组相比差异均无统计学意义（图6A、6B）；两组肠道组织闭合蛋白及ZO-1的蛋白表达差异也无统计学意义（图6C、6D）。

免疫组化结果也显示，NC-Abx 组及HF-Abx组小鼠回肠上皮紧密连接蛋白阳性表达减少且染色强度减弱，细胞间阳性表达不连续，较稀疏（图7A、7B）。Image-Pro 图像软件半定量分析显示，NC-Abx 组小鼠与NC 组相比，闭合蛋白（P＜0.001）和ZO-1（P=0.032）阳性表达显著下降（图7C、7D）；HF 组小鼠与NC 组相比，闭合蛋白（P＜0.001）和ZO-1（P=0.005）阳性表达显著下降（图7C、7D）；而HF 组与HF-Abx 组小鼠回肠上皮紧密连接蛋白表达差异无统计学意义（图7C、7D）。

图7 各组小鼠回肠上皮紧密连接蛋白表达的免疫组化结果Fig 7 Immunohistochemistry of tight-junction protein expression in the ileal epithelium of mice from different groups

讨 论

本研究通过四联广谱抗生素（万古霉素+甲硝唑+硫酸新霉素+氨苄青霉素）清除小鼠肠道内90%以上的微生物［12］，从而建立一个“无菌”的肠道环境。王亚涛等［13］也曾用口服混合非吸收性抗生素饮用水（庆大霉素、磺卞青霉素、头孢硫脒、两性霉素B），建立伪肠道无菌动物模型。本研究发现在不同饲料（饮食）环境下，缺少肠道菌群对宿主动脉粥样硬化、炎症水平有着截然不同的影响。

在高脂饲料喂养下，清除肠道微生物的小鼠摄食量明显增多，但与之相反的是体质量却没有明显增长：四联抗生素干预的高脂饲料组小鼠体质量在干预后期显著低于高脂饲料组，且与普通饲料喂养的小鼠相比，差异无统计学意义。这一结果与Gordon 实验室的经典研究结果类似：无菌小鼠比悉生小鼠摄入更多的饲料，但前者体质量及体内脂肪含量却更低［14］。肠道菌群能够分解代谢食物中的膳食纤维，产生短链脂肪酸。短链脂肪酸能被小肠上皮细胞吸收进入血液循环，运往机体其他组织细胞的线粒体内进行β 氧化供能，从而增加从食物中的能量获取，提高食物利用率。此外，肠道菌群能够抑制肠道内禁食诱导脂肪细胞因子（fastinginduced adipocyte factor，Fiaf）的表达，使得脂肪细胞肥大；还可以上调脂肪合成基因的表达，使甘油三酯在肝脏和脂肪组织中堆积［15］。无菌小鼠因为缺乏肠道菌群作用，虽然摄食比正常小鼠多，但是体质量和脂肪却反而更少。

本研究还观察到高脂饲料喂养，清除肠道菌群的小鼠动脉粥样硬化斑块的面积明显下降，血清总胆固醇水平明显降低，且血清LPS 水平及肠道炎症因子表达显著下降。这说明在高脂饮食诱导的系统性慢性炎症状态下，清除肠道微生物群能够减轻宿主炎症状态。曾有学者尝试用抗生素对冠心病患者进行干预，但最新的综述显示抗生素用于冠心病的二级预防似乎是有害而无益的［2］。

Rakoff-Nahoum 等［12］研究显示肠道共生菌在稳态条件下被TLRs 识别，它们的相互作用在维持宿主肠上皮细胞稳态及预防肠道损伤中起重要作用，由此认为肠道共生菌对防止肠上皮损伤是必需的。此外，膳食纤维只能通过肠道菌群在结肠中发酵，膳食纤维发酵的终产物是短链脂肪酸，其中丁酸是结肠上皮的能量底物，并且在免疫功能和肠道屏障完整性方面也有作用［16-18］。因此，缺乏肠道菌群对宿主肠上皮功能影响显著。本研究结果也显示无论是普通饲料还是高脂饲料喂养，清除肠道微生物群后小鼠肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达均明显下降，肠道通透性因紧密连接蛋白的表达减少而受损，并在肠上皮细胞死亡和再生之间造成不平衡［19］，肠道机械屏障功能受损，而肠道屏障的完整性对于维持宿主的健康以及预防动脉粥样硬化的发生发展至关重要。

高脂饮食可引起小鼠肠道内环境的紊乱，损害肠道屏障的完整性，使肠道屏障的通透性升高，引起代谢性内毒素血症，增加系统性慢性炎症［20-21］。我们发现广谱四联抗生素清除宿主肠道菌群后，虽然可以减轻高脂饮食诱导的代谢性内毒素血症，减少肠上皮细胞炎症因子的表达，但是肠上皮细胞紧密连接蛋白的表达依旧下降，肠上皮机械屏障依旧处于受损状态。因为抗生素整体抑制了高脂饮食诱导的炎症状态，所以虽然肠道机械屏障功能不全，但肠源性内毒素水平不高。考虑到人类的饮食种类及结构更丰富，生活环境比实验小鼠更复杂，应用抗生素在清除肠道微生物减轻炎症的同时，肠上皮屏障受损可能会带来免疫和代谢方面更多不利的影响。研究显示，肠道菌群的代谢产物短链脂肪酸在维持急性心梗宿主心肌修复能力方面也发挥重要作用［18］。这些可能是抗生素治疗冠心病的人群研究尚无临床获益的原因之一。

与高脂饲料喂养相反的是，普通饲料喂养的小鼠在清除肠道微生物后动脉粥样硬化斑块面积明显升高，这一结果与Stepankova 等［22］对无菌小鼠的研究结果是一致的。缺乏肠道共生菌的小鼠血清炎症因子TNF-α 和IL-1β 水平均比对照小鼠明显升高，且前者肠上皮细胞炎症因子表达也明显增多。这样看来，在普通饲料喂养的环境下，清除正常肠道共生菌引起ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的发生发展与宿主炎症水平升高有关，后者又与宿主肠上皮屏障受损有关。我们认为普通饲料喂养下，小鼠肠道建立了一个无致病菌的正常共生菌环境，而广谱四联抗生素清除了小鼠90%以上的肠道微生物群后，破坏了正常共生菌环境，肠上皮屏障受损，反而引起小鼠炎症水平升高，促进了动脉粥样硬化的发生发展。因此，我们推测正常肠道共生菌对宿主动脉粥样硬化具有保护性作用，这一作用与肠道共生菌群在稳态条件下维持宿主肠道屏障完整性及预防肠道损伤有关。

本研究存在一定不足和局限性：未进行小鼠糖代谢方面的检测，未探讨肠道共生菌、糖代谢与动脉粥样硬化之间的相关性。虽然文献支持四联抗生素能够清除宿主肠道90%以上的正常共生菌，但本研究未检测小鼠肠道菌群的情况，今后研究中仍需进行相关的探索。

本研究再次证实了炎症在动脉粥样硬化斑块的发生发展中起主要作用，明确了正常肠道共生菌对宿主动脉粥样硬化具有保护性作用。今后将进一步深入研究调节炎症和动脉粥样硬化之间的具体机制，在不影响肠道屏障功能的情况下，特定的或靶向的抗炎治疗手段有可能改变宿主动脉粥样硬化的进程。

作者贡献声明朱琳 论文构思和撰写，数据整理，制图。蒯铮 动物实验。宋乐 数据分析。胡予，沈锡中 研究设计，实验指导。张丹瑛 论文构思、指导和修改。

利益冲突声明所有作者均声明不存在利益冲突。