李志情, 孙文昊, 韦玉连, 聂莎, 唐耀平,4*

(1.广西中医药大学瑞康临床医学院, 南宁 530200; 2.广西中医药大学附属瑞康医院, 心血管内科, 南宁 530011; 3.南方医科大学中西医结合医院, 广州 510315; 4.广西高发传染病中西医结合转化医学重点实验室, 南宁 530200)

随着生活条件不断改善,人类心血管危险事件发生率不断升高,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心血管危险事件发生的病理基础,多侵犯于冠状动脉、脑动脉、肾动脉、肠系膜动脉、下肢动脉等部位,可引起心绞痛、心肌梗死、脑梗死、脑出血、顽固性高血压病、麻痹性肠梗阻、间歇性跛行等疾病[1-2]。AS的病因多与吸烟、嗜酒、重盐重油饮食、高血压病、糖尿病、高血脂症等生活习惯和疾病相关,其发病机制与炎性反应、内皮损伤、氧化应激、脂质浸润、细胞凋亡、血小板聚集等密切关联[3-4]。AS由血管内皮损伤来启动,血小板进一步促进损伤,在AS的发病中发挥着重要作用[5-6]。目前临床上治疗多以西药治疗为主,常用他汀类、利尿剂、血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体拮抗剂(ARB)、双胍类等药物调节血脂水平、降低血压、控制血糖,同时调整生活饮食习惯,加强运动锻炼等。但西医治疗虽有一定疗效,但不良反应多,难以长期坚持,出血风险性高,停药后容易病情反复[7-8]。

中医以整体观为指导,多层次、多靶位的作用于AS,具有独特优势[9]。由于AS斑块涉及内皮细胞、血小板、巨噬细胞、平滑肌细胞等,客观上需要中医在微观施治方面进行深入研究。文献[10-12]表明,中医复方可以通过抗血小板聚集发挥抗AS作用,但对其中发挥核心作用的药对,尤其是角药(三味药的组合)未有深入探索。随着信息科学技术的不断发展,数据挖掘与网络药理学技术在中药复方配伍分析的运用越来越多,相关技术逐渐成熟[13-14]。

现通过数据挖掘和网络药理学方式评价干预血小板聚集抗AS的中药复方,找出并分析核心角药组合,阐明其与疾病相关的潜在靶位以及信息通道,为优化组方和深入研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究资料

所用文献主要源于中国知网,以“动脉粥样硬化、粥样硬化、抗血小板聚集、血小板、凝血功能、凝血、中药复方、方、汤”等为主题词进行检索,检索时限均为建库起至2022年7月8日,初检出269篇相关文献,从中整理出通过干预血小板聚集抗动脉粥样硬化的方剂及其药物组成,最后筛选出50个中药复方,涉及109味中药。

1.2 处方筛选

利用中医传承系统 (V2.5)统计纳入药物性味归经分析。将其结果在 Excel 2010软件中详细列出。通过IBM SPSS Statistics 25及IBM SPSS Modeler18统计软件对药物数据进行内在联系、规律以及群集分析。

1.2.1 纳入标准

(1)中医方剂或中西医结合通过干预血小板聚集抗 AS 的相关文献(文献中有中药方剂者)。

(2)完整说明方剂具体内容。

(3)具有明确疗效标准的基础研究。

(4)汤剂、丸剂、散剂、胶囊、注射液等剂型均可(文献中有中药具体组成)。

1.2.2 排除标准

(1)方中方药组成不完整。

(2)重复的文献及组方只纳一次(两方合用者除外)。

(3)临床观察研究。

(4)名家经典医案、经验探讨等。

1.2.3 筛选结果

初检得到269篇文献,按照纳入以及排除标准最终选得60篇文献,删除重复方剂,总结归纳出方剂50首。

1.3 中药名称规范

本次研究所运用的中药名称均参考《中国药典》[15]、《中药学》[16]进行规范处理,以避免系统对药物分析产生误差,其中将川牛膝、怀牛膝、姜半夏、法半夏、生甘草、炙甘草等药物均分别统称为牛膝、半夏、甘草。

1.4 核心角药及疾病相关靶点的收集与筛选

将上述得出的核心药对输入 TCMSP 数据库,找出其活性化合物以及药物的作用靶位,导入 Excel 2010表进行备用。运用 UniProt数据库,设置物种为人,同时根据标准名称校正靶点蛋白。采用 Venny软件得出角药与疾病的关键靶位。利用 Cytoscape 3.7.1 软件获取核心角药与疾病交集靶位并构建网络图。

1.5 PPI网络分析与核心靶点筛选

运用STRING数据库和Cytoscape 软件构建蛋白互作的网络图(protein-protein interaction,PPI),设置蛋白类型为“人”,获得蛋白之间的关系。按度(degree)值大小最终筛选出核心靶位。其中degree 值通过节点大小体现,综合值(combined score)通过边的粗细直观表现。

1.6 GO KEGG功能富集分析

GO KEGG富集分析选择在metascape数据库中进行,为预测核心角药干预血小板聚集抗动脉粥样硬化的生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecularfunction,MF)、细胞组分(cellular component,CC)、KEGG通路。

2 结果

2.1 数据挖掘结果

2.1.1 药物性味归经分析

运用中医传承辅助平台(V2.5)得出药物四气为温、热性药120次,寒、凉性96次,平性48次。五味以苦味药150次,甘味120次,辛味90次。归经以入肝经150次,入脾经140次,入心经136次(图1～图3)。

图1 四气统计雷达图Fig.1 Statistical radar chart of four gases

图3 归经统计雷达图Fig.3 Warp statistic radar chart

2.1.2 药物关联规则分析

利用IBM SPSS Modeler18.0软件对药物进行内在联系、规律分析,将最低支持度和置信度设定为 20%和85%,最大前项数限定为 5,共得出32组核心角药,去除药对,最终得出核心角药24组,依据置信度、支持度选出居前3位者为“川芎-桃仁-红花、红花-桃仁-川芎、红花-桃仁-当归”(表 1)。进一步用网络图进行展示,药物之间连线的粗细和颜色的深浅说明两者间密切程度。其结果显示,当归、桃仁、红花、丹参、连翘关联程度最高,关系最为密切(图4)。

表1 药物关联规则分析Table 1 Analysis of drug association rules

图4 药物关联度网络图Fig.4 Drug association degree network diagram

2.1.3 药物聚类分析

采用IBM SPSS Statistics 25系统对前20个药物进行聚类分析分成4类(表2),聚类分析树状图如图5所示。

表2 聚类分析Table 2 Cluster analysis

图5 聚类分析树状图Fig.5 Dendrogram of cluster analysis

2.2 网络药理学结果

2.2.1 核心角药与疾病相关靶点的筛选

选择中药系统药理学数据库与分析平台,对生物利用度(oral bioavailability,OB)限定为≥30%,对类药性(drug like,DL)限定为≥0.18,获取核心角药“川芎、红花、桃仁”的药物成分及潜在靶点的信息,将核心药物的有效成分及靶点导入Excel 2010,去重整合后结果如下:川芎、红花、桃仁分别包含6、13、19种成分; 42、436、139个靶位。运用Genecards、OMIN、Drugbank、TTD等数据库取得疾病靶位,分别输入关键词“atherosclerosis、platelet aggregation”,得到相应靶点分别为“1 177、898”“134、132”“47、16”“0、2”个,其中 Genecards数据库筛选 Score≥1.135的基因,将各数据库靶点录入Excel 2010表中,对靶点进行整合,去除重复值后,最终得到疾病靶点390个。整合相关交集靶位后通过Venny软件,生成“动脉粥样硬化-血小板聚集、药物-疾病”韦恩图(图 6、图7),得出药物与疾病共有80个交集靶位。

图6 动脉粥样硬化-血小板聚集韦恩图Fig.6 Venn diagram of atherosclerosis and platelet aggregation

图7 中药-疾病韦恩图Fig.7 Venn diagram of TCM-disease

2.2.2 PPI网络构建分析

将药物-疾病交集靶位数据录入string数据库中,同时设定物种为“人”,高置信值为 0.900,隐藏网络中断开的节点,结果得出78个核心靶位并导入Cytoscape3.7.2软件中构建PPI网络图,如图8所示,共有节点78个,272条边。应用Network Analyzer 工具进行拓扑数据分析,度值大小通过节点大小、颜色深浅体现。获取JUN靶点相关节点第一层,图中共有节点27个,110条边(图9),Degree值前十的靶位是JUN、AKT1、TNF、IL6、TP53、MAPK1、CTNNB1、MAPK14、FOS、CAV1(表3)。

表3 Degree值前10关键靶点Table 3 Top 10 key targets in degree value

图8 PPI网络图Fig.8 PPI network diagram

图9 JUN靶点相关节点第一层网络图Fig.9 First-layer network diagram of relevant nodes of Jun target

2.2.3 药物成分-靶点-疾病网络构建分析

将药物各活性成分及核心靶点数据导入Excel 2010表格中建立相互对应关系,运用 Cytoscape 3.7.2软件制作“药物成分-靶点-疾病”网络图(图10)。共有593个节点,1 007条边,同时进行拓扑分析。结果表明,各成分依据degree值高低排序,排名前 10 的成分为quercetin、kaempferol、luteolin、beta-sitosterol、baicalein、Stigmasterol、Myricanone、hederagenin、beta-carotene、6-Hydroxykaempferol,其中红花中quercetin居首位,表明红花中quercetin成分在干预血小板聚集抗动脉粥样硬化中起主要作用。

2.2.4 GO、KEGG 富集分析

通过metascape数据库对“川芎-桃仁-红花”核心角药干预血小板聚集抗AS的80个交集靶点进行GO 富集分析,结果显示共5 501条,得出BP 4 599条, CC 376条, MF 526条。在生物过程中主要有运动的正向调节、细胞成分运动的正向调节、细胞运动的正向调节等;在细胞组分中主要参与了膜筏、膜微区、囊泡腔等细胞组分;在分子功能中主要信息受体调节剂活性、信息受体激活剂活性、转录因子结合等,制作气泡图进行可视化展示(图11～图13)。

利用metascape数据库对作为核心角药的“川芎-桃仁-红花”干预血小板聚集抗 AS的共有靶位进行KEGG富集研究,将80个靶点导入到数据库中,结果显示共234条,核心靶点主要富集在AGE-RAGE在糖尿病并发症的信息通道、癌症相关通道、血脂与AS相关通道、松弛素信息通道和HIF-1信息通道等(图14)。

3 讨论

AS是一种由多种原因引起的血管慢性病变,可引起冠心病、脑卒中及外周血管病等[17]。血小板在AS的发生发展起着重要的作用,通过调节血小板活化、激活内皮细胞、触发炎症反应、刺激血管平滑肌细胞增殖等机制影响AS的进程[18-19]。故抗血小板聚集是防治AS的主要手段之一[20]。AS属于中医的“胸痹”“中风”“厥心痛”等疾病范畴,与痰、浊、瘀、毒、虚等病理相关。以脏腑阴阳气血不足为本,以痰饮、湿浊、血瘀、毒邪为标,病机为本虚标实,治以补虚、化痰、解毒、活血为主。其中,“血瘀”是直接引起相关血流动力学障碍的关键因素,故活血化瘀法贯穿整个抗AS始终[21-23]。

本次研究通过数据挖掘发现干预血小板抗 AS 的中药以活血化瘀、行气止痛为主,辅以补气化痰散结。根据关联规则分析以及药物系统聚类分析,结合角药的支持度以及置信度综合对比,选出核心角药“川芎-红花-桃仁”。其中,红花可以起到活血通经、祛瘀止痛的作用,川芎可以起到活血祛风,行气止痛的作用,桃仁可以起到活血祛瘀的作用,以上三药性味多以甘、温、苦为主,主要归心肝经,与干预血小板聚集治疗AS的机制相吻合。现代药理研究显示[24-27],红花可以起到抗氧化、参与免疫调节、抗炎等功效。川芎可以起到抗血小板聚集、扩张冠状动脉、改善心肌缺血缺氧、保护血管内皮细胞功能等功效。桃仁可以起到改善血流速度、降低全血黏度、血浆黏度等功效,与干预血小板聚集治疗AS的机制相吻合。

图12 GO细胞组分通路富集气泡图Fig.12 GO cell component pathway enrichment bubble diagram

图13 GO分子功能通路富集气泡图Fig.13 Bubble diagram of GO molecular functional pathway enrichment

图14 KEGG通路富集图谱Fig.14 Enrichment map of KEGG pathway

运用网络药理学对“川芎-红花-桃仁”核心角药进行分析,得出核心角药与疾病前十位靶点分别是JUN、AKT1、TNF、IL6、TP53、MAPK1、CTNNB1、MAPK14、FOS、CAV1;干预血小板聚集抗AS中主要靶点是JUN,文献[28]表明Jun原癌基因与血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶、细胞炎症因子等促凋亡因子的表达有密切关联,可影响血管形成。AKT1属于AMP/GMP 激酶的总类之一,AKT1参与细胞生长和增值、细胞存活和凋亡、血管生成和舒张、营养物质的吸收或细胞葡萄糖和脂质代谢等过程[29]。TNF属于促炎细胞因子,可以改善血管内皮功能、凝血功能、胰岛素功能以及脂质代谢过程,从而达到抗AS的作用[30-31]。说明通过调节JUN、AKT1、TNF靶点蛋白,可以有效的抗AS。

核心角药干预血小板聚集抗AS起主要作用前三位活性成分quercetin、kaempferol、luteolin。文献[32-33]表明,槲皮素可以明显改善血流减慢,通过影响血小板颗粒的胞外分泌、血小板的胶原和纤维素静态黏附功能,从而有效改善动脉粥样硬化病变。山奈酚属于天然类黄酮,具有抗炎、抗凋亡和抗癌作用。有研究表明山奈酚通过干预 GPER调节 PI3K/AKT/Nrf2 信号通道抑制氧化应激、炎症和细胞凋亡,进而防止AS[34]。木犀草素具有抗炎、抗癌、抗氧化等功效[35]。文献[36]表明木犀草素可影响血管平滑肌细胞的增殖和迁移,主要通过调节AKT和Src,并通过与 mRNA 稳定性和 NOX4/ROS-NF-κB 通路相关的 TTP 激活来减少炎症和氧化损伤,以预防AS形成。 所以“川芎-红花-桃仁”核心角药干预血小板聚集抗AS的主要活性成分可能是槲皮素、山柰酚、木犀草素等活性成分,其具有重要研究价值。

本研究发现核心角药的靶位主要集中在AGE-RAGE信息通道在糖尿病并发症中的作用、癌症相关信息通道、脂质和AS信息通道、松弛素信息通道、HIF-1等信息通道。文献[37-38]表明,松弛素信息通道可促进血小板衍生生长因子大量表达,使其促进血小板的极性移动凝聚到血管壁损伤部位促进 AS发展。

综上所述,本研究运用数据挖掘,基于关联规则及聚类分析,找出了核心角药“川芎-红花-桃仁”,并利用网络药理学方法对核心角药进行相关靶点、信号通路研究,初步揭示其具有调节JUN、AKT1、TNF靶点蛋白以及脂质和AS相关信息通道、癌症相关信息通道、松弛素信息通道以及HIF-1信息通道作用。为中医防治AS找到有效的药物组合,初步揭示了中医靶向防治 AS 血小板聚集的可能机制,为深入进行中医的微观靶向研究提供了参考。

4 结论

通过数据挖掘与网络药理学方法,从整体上分析中药复方通过干预血小板聚集抗AS的用药规律,结果得出其干预血小板聚集抗AS的方剂多以活血化瘀、行气止痛为主,辅以补气化痰散结,槲皮素、山柰酚、木犀草素为干预血小板聚集抗AS的重要有效成分,最后得出关键靶点和信号通路,阐明核心角药的作用机制,同时,后期还可运用多组学技术、分子对接技术等进一步佐证,为今后优化组方提供一个新的处方思路以及为中医药治疗AS的临床研究提供重要基础价值。