任青燕，陆子鑫，涂盈颖，韦 力，乔 芬

（丽水学院生态学院，浙江 丽水 323000）

冠状病毒（Coronavirus）是一种单链RNA 病毒，具有球形颗粒和包膜结构，其基因组大小为27～32 kb［1-2］，在物种分类中，冠状病毒属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒亚目（Cornidovirineae）冠状病毒科（Coronaviridae）［3］。2018 年国际病毒学分类委员会将冠状病毒科分成勒托病毒亚科（Letovirinae）和正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）两个亚科［4］。勒托病毒亚科仅包含一个属，即甲勒托病毒属（Alphaletovirus）。正冠状病毒亚科基于基因型和血清学则可分为4个属，即α、β、γ和δ冠状病毒属［5-6］，其中α、β冠状病毒属病毒主要感染哺乳动物和人，γ和δ冠状病毒属病毒主要感染禽类和猪［1，7］。冠状病毒的宿主范围很广，可以通过动物跨物种感染人类，甚至导致人际传播［8-9］。冠状病毒具有较强的传染性，且致死率高［10］。经过科学家在电子显微镜下的观察以及结合基因组测序结果，确认新型冠状病毒感染（corona virus disease 2019，2019-nCoV，简称 “新冠感染” ）为由新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病［11］。由于该病毒与SARS-CoV 具有较高的相似性，都属于β冠状病毒属，与SARS-CoV 是姊妹病毒，对人类的健康造成重大威胁，国际病毒命名委员会将其改命名为SARS-CoV-2［12］，因序列信息注释中使用的为2019-nCoV，所以本文使用2019-nCoV。除2019-nCoV 外，目前已发现能感染人的冠状病毒有6 种，分别是属于α-CoV 的HCoV-229E 和HCoV-NL63，属于β-CoV 的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV［13］。近10多年来，由冠状病毒引起的烈性传染病已经严重危害到人类健康，针对冠状病毒的预防及研究已然成为全世界必须重视的工作。新型冠状病毒具有传播速率快、范围广、传染性强、易感性强等特点［14］。新型冠状病毒感染的临床表现以发热、乏力、干咳为主，少数伴有鼻塞、流鼻涕、咽痛、恶心、腹泻等症状。重症患者发病一周后常有呼吸困难的症状，并迅速发展为急性呼吸窘迫综合征、败血症、感染性休克、代谢性酸中毒和凝血功能障碍，部分患者甚至死于多器官功能衰竭［3，15］。由于新冠感染患者众多，对于患者的康复治疗俨然成为当今社会棘手的问题。对于新冠感染的治疗，临床上可以考虑借鉴非典型肺炎和中东呼吸综合征的治疗方案。中草药治疗体现出一定优势：早期干预、阻断病程、减轻症状、缩短治疗时间、减少并发症、减少大剂量激素引起的毒副作用［16］。

冠状病毒含有30 kb大小的基因组和4种编码结构蛋白，分别为刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）及核衣壳蛋白（N）［10］。通常有一些小的开放读码框（ORFs）存在于结构蛋白之间。通过体外实验证明，虽然某些ORFs对病毒复制不是必需的，但与病毒的致病性存在联系，同时还可以决定病毒的种群特异性［2］。因此，选择冠状病毒中合适的蛋白序列进行进化树构建和分析是非常有必要的。

冠状病毒的S蛋白由1 160～1 400个氨基酸组成，包括21～35 个N-糖基化位点。S 蛋白以三聚体的形态在病毒表面形成特殊的皇冠结构，冠状病毒因此而得名［7］。S 蛋白的作用是负责结合病毒受体、介导宿主细胞的融合以及诱导机体产生中和抗体，是一种重要的毒力蛋白［17］。S 蛋白由S基因编码，S基因突变能力较强，是毒株毒力的指征性基因，其突变和重组可能会影响冠状病毒的毒力，进而产生新的毒株。同时S蛋白也是新型冠状病毒与人类细胞受体ACE2结合的关键，在病毒侵袭和感染人体的过程中起到关键作用［18］。冠状病毒N 蛋白是指核衣壳蛋白，与病毒基因组RNA互相缠绕形成病毒核衣壳［19］。N 蛋白被N基因编码，在病毒粒子组装过程中起到决定性作用，是一种重要的结构蛋白［20］。N 蛋白具有增强病毒基因组转录、在病毒组装过程中与其他蛋白质结合、通过破坏各种细胞活动而对宿主细胞产生毒性等不同特征［21］，并且可刺激宿主产生具有高亲和力但没有中和活性的抗体。在CoV的结构蛋白中，N蛋白是最保守和最稳定的蛋白［22］。对于冠状病毒而言，S 蛋白影响其毒力且易突变，而N 蛋白决定其结构相对稳定。故选择冠状病毒S、N蛋白序列作为构建进化树的主要数据。

目前，大部分冠状病毒的蛋白序列信息已被收录在世界主要的蛋白数据库GenBank 中。本研究通过对冠状病毒蛋白序列进行筛选和整理，运用MEGA7.0 软件构建进化树并分析其进化关系，同时比较S、N 蛋白构建进化树的区别，为认识和研究冠状病毒打下基础。

1 材料与方法

1.1 数据的来源与蛋白选择

本文所有冠状病毒蛋白序列信息均来自于GenBank 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/）。从GenBank数据库中筛选冠状病毒S、N蛋白序列各30条，序列包括来自寄主为人、猪、牛、羊、犬、猫、鼠、禽、蝙蝠、骆驼的冠状病毒S蛋白和N蛋白，包括2株2019-nCoV序列和28株具有代表性的α、β、γ和δ冠状病毒属的冠状病毒，同时对其序列进行进化分析。其中有云南省的中菊头蝠冠状病毒RaTG13，以及SARS-CoV、MERS-CoV 和其他蝙蝠冠状病毒，还包括α冠状病毒属的宿主为猫、狗、猪和人的冠状病毒，β冠状病毒属的宿主为骆驼、牛、兔、马和人的冠状病毒，γ冠状病毒属的不同宿主（火鸡、鸽）的冠状病毒，δ冠状病毒属的夜莺冠状病毒HKU11和画眉冠状病毒HKU12（表1、表2）。

表1 冠状病毒S蛋白序列信息

1.2 进化树构建

运用MEGA 7.0 软件进行多序列比对，采用距离依靠法中的邻接法（neighbor-joining，N-J）构建N-J 进化树。将在GenBank 上下载到的冠状病毒蛋白序列以FASTA 格式导入MEGA 7.0 进行多序列与模型筛选。进化树构建使用p-distance模型，选择Bootstrap值5 000，其他为默认值。

1.3 保守基序分析

冠病毒代表性N 蛋白和S 蛋白序列保守基序motif 预测通过MEME在线网站进行（https：//memesuite.org/meme/tools/meme）［23］，基序最大数量设置为3，数据结果使用TBtools 进行可视化［24］。

2 结果

2.1 基于S蛋白的进化关系分析

S 蛋白进化分析结果显示：β属新型冠状病毒聚到一个大的分支，其中2019-nCoV 与分离自云南省的中菊头蝠冠状病毒RaTG13关系最近，其次与SARS 相关毒株的进化关系较近。多种哺乳类动物感染的α冠状病毒属、家养禽类感染的γ冠状病毒属、野生禽类感染的δ冠状病毒属的冠状病毒与2019-nCoV 关系较远。然而α、γ、δ冠状病毒属之间没有很好地区分成独立的分支，尤其是猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）未与其他株系聚类到一起，表明其可能与其他毒株进化关系较远（图1）。

图1 冠状病毒S蛋白构建进化树结果图

2.2 基于N蛋白的进化关系分析

N蛋白进化分析结果显示：α、β属冠状病毒分别聚到2个大的分支中，γ冠状病毒属与δ冠状病毒属聚到了1 个分支中。新型冠状病毒2019-nCoV 同样与分离自云南省的中菊头蝠冠状病毒RaTG13 关系最近；其次与人和蝙蝠感染的SARS冠状病毒具有较近的关系，尤其是蝙蝠感染的SARS冠状病毒HKU3-2。其他哺乳类动物和禽类感染的α冠状病毒属、γ冠状病毒属、δ冠状病毒属病毒与新型冠状病毒2019-nCoV 的关系较远。该结果与S蛋白进化关系分析结果相似（图2）。

图2 冠状病毒N蛋白构建进化树结果图

2.3 冠状病毒N蛋白与S蛋白的保守基序分析

利用MEME 软件对该N、S蛋白的保守元件进行分析，如图3 所示：N 蛋白中，选择的30 个蛋白中有9 个只含有motif 1 和motif 2 保守元件，其他成员含有3 个保守元件，保守元件在蛋白中的分布相对均匀。S 蛋白中，选择的30 个蛋白均含有motif 1、motif 2 和motif 3 保守元件，且集中在C端，整体看来保守元件所在位置和保守元件种类高度相似，表明冠状病毒的N、S 蛋白具有一定的保守性。

图3 冠状病毒的N、S蛋白保守元件分析

3 讨论

冠状病毒可感染人和多种动物，例如猪、牛、羊、犬、猫、鼠等。一些宿主可以被多种冠状病毒感染，而一种冠状病毒也可以感染多个宿主［25］。冠状病毒还可以感染鸡、鸭、鹅、鸽子、麻雀等禽类动物，其中：鸡传染性支气管炎病毒（IBV）和火鸡冠状病毒属于γ 属冠状病毒；夜莺冠状病毒HKU11、鹅口疮冠状病毒HKU12 等属于δ属冠状病毒［26］。最早的冠状病毒是由鸡身上分离出来的，即鸡传染性支气管炎病毒（IBV），因此禽类是冠状病毒的早期宿主。故选择禽类、猪、牛、羊、犬、猫、鼠的冠状病毒蛋白或基因序列作为构建进化树的数据，有助于对冠状病毒进化关系及其对人类潜在的危害性的分析。蝙蝠是马尔堡病毒、狂犬病病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒等多种侵染人类的病毒的天然宿主，也被认为是SARS-CoV、MERS-CoV和2019-nCoV 的天然宿主［26］。另有研究表明：单峰骆驼是中东呼吸综合征冠状病毒的主要宿主（MERS-CoV），并且是人群中出现中东呼吸综合征感染的动物来源［27-28］。

本研究运用S、N两种蛋白序列构建冠状病毒进化树所得的进化关系总体上相似，β冠状病毒属的新型冠状病毒2019-nCoV与分离自云南省的中菊头蝠冠状病毒RaTG13关系最近，其次与人和蝙蝠感染的SARS冠状病毒具有较近的关系，然而基于S 蛋白的进化分析没有很好地将α、γ、δ冠状病毒属区分成独立的分支，尤其是猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）未与其他株系聚类到一起，说明运用S 蛋白建树所得结果存在一定偏差。一些研究运用二代测序结合三代测序获得2019-nCoV 全基因组序列，测序长度为29 688～29 899 bp，并涵盖了全部病毒的编码区［25］。通过对39株2019-nCoV的全长基因组核苷酸序列进行比对，证明其与SARS 冠状病毒（SARS-CoV）的基因相似性平均为78.7%［26］，说明2019-nCoV与人和蝙蝠感染的SARS冠状病毒的确具有较近的关系，与N蛋白构建的进化树结果一致。笔者推测：与S蛋白相比，运用N 蛋白构建冠状病毒进化树更合适，所得到的进化关系也更加准确。

新型冠状病毒于2019 年12 月初在中国被报道，对人类健康的危害程度已远超2003 年暴发的SARS病毒［27］。本研究通过S、N蛋白序列构建进化树，表明新型冠状病毒2019-nCoV与分离自云南省的中菊头蝠冠状病毒RaTG13 关系最近，并且与SARS-CoV也存在较近的关系，与全长基因组核苷酸序列进化关系分析结果一致［26］。因此，可借鉴SARS的预防与治疗思路。由于新冠病毒的突变率较高，病毒群体在较短时间内便可积累相当数量的突变，进化方向不可预测，从进化生物学和群体遗传学的角度分析，其结果有助于新冠病毒的监测与防控［29］。公众、各地疾病预防控制中心和社区医生需要认识冠状病毒及其遗传进化关系，以促进对新冠病毒的预防与治疗［30］。