褚章杉, 黄馨慧, 钱永强

(中国林业科学研究院生态保护与修复研究所/国家林业和草原局草原研究中心, 北京 100091)

种子作为植物繁殖的器官和载体,是生物多样性的基本组成部分,在生态系统中占有重要的地位。同一物种内部种子特征通常被认为是相对稳定的,但也有研究表明在种群间,甚至个体间,种子特征会有较大差异[1]。而种子的生物学特征往往会受到自然环境胁迫的影响,是植物长期适应环境后进化的产物,能够反映其生存环境的变化[2],对种子萌发、幼苗生长和种苗定植具有显著的影响。在种子植物中禾本科类是最有经济价值的大科之一,其覆盖面积约占地球陆地面积的20%,其中许多禾草植物在草地和草原生态改良、人工草地建植以及城市绿地景观建设中发挥了重要作用[3]。但目前国内80%左右的禾草种子仍依靠国外进口,对禾草种子资源的收集和研究亟需进一步深入[4]。

野牛草(Buchloedactyloides)又名水牛草、牛毛草,为禾本科(Gramineae)野牛草属(Buchloe)多年生低矮草本植物,原产于北美中部半干旱和亚热带地区,是一种重要的经济草种[5]。作为牧草,野牛草具有较高营养价值和适口性;作为草坪草,野牛草抗逆性、适应性强,养护管理简单、需肥量少、用水率低,匍匐茎蔓延生长旺盛,可快速形成密集草皮,如今广泛应用于城市绿地、护路护坡、生态修复等不同场景中[6-7],需求量逐年增加。然而随着野牛草的不断应用,发现其种子质量不稳定,优良品种供应量不能满足需求;同时种子还表现出较强休眠性,自然萌发率较低,这严重影响了野牛草的播种育苗以及良好草坪的建植,限制了自身生产和应用。

草种质资源是决定草坪建植质量的关键因素,种子质量的优劣直接影响其应用效果,因此筛选优良种质成为培养良种的重要环节[8]。进行种子生物学特性的评价,不仅是鉴定野牛草种质资源的基础,也是分析了解其种质遗传多样性的重要手段,对筛选出适应我国环境特点的种质资源具有重要意义。基于此,本研究以大田中50份野牛草野生种质资源为试验材料,观察测量种子性状的多样性,比较分析不同种质资源间形态特征、质量特征以及萌发特性的变异程度,并依据不同性状指标进行划分,筛选性状表现优良的野牛草种质为优良品种和新品种的选育提供基础材料。

1 材料与方法

1.1 试验地概况与试验材料

试验地位于山东省莒县野牛草种质资源圃(118 °35 ′E～119 °06 ′E,35 °19 ′N～36 °02 ′N),平均海拔为147 m,属于暖温带季风区大陆性气候,年均气温为12.1℃,年均降水量为837.5 mm,土壤以褐土为主。试验材料是于2022年7月份对野牛草不同种质资源进行田间调查后采集的,总共收集了50份成熟的野牛草种子材料,具体采集信息如表1所示。采集后所有野牛草种子置于室外进行晾晒干燥,清选去除杂质后装入网袋于室温下保存备用。

表1 供试野牛草种子材料的采集信息Table 1 Seed sampling information of Buchloe dactyloides germplasm resources

1.2 试验测定指标与方法

1.2.1种子形态特征的观测 采用4分法分别选取野牛草不同种质资源的种子,目测观察种球和颖果的外观形状、表面颜色、质感及解剖结构,并以种子上下两端纵轴间距为长度;垂直纵轴的最大横断面直径为宽度;种子平放时上下腹面间距离为厚度[9],使用精度为0.01 mm的电子游标卡尺对种球长宽厚、种球长宽比、颖果长宽厚和颖果长宽比进行测量。

1.2.2颖苞占比和饱满度的测定 颖苞占比和饱满度采用直观统计法测定[10]。分别选取不同种质资源各30粒种球,设置3次重复,称量种球重量后人工剥除外部颖苞结构,再称量颖苞的总重量,同时记录每个种球内饱满和败坏的颖果数,按照公式计算颖苞占比和饱满度。

1.2.3种子千粒重和生活力的测定 千粒重采用百粒重法测定。各种质资源每次随机选取100粒种球和颖果,分别用电子分析天平称量重量,每个种质重复测定3次,百粒重平均值乘以10即为千粒重。

生活力采用TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色法测定。分别取不同种质资源的颖果各3份,每份100粒,蒸馏水浸泡吸胀后,用刀片沿纵轴进行纵切,取一半放入培养皿中加入1.0%TTC溶液。培养皿放入25℃恒温箱内避光染色24 h后取出,自来水淋洗2～3次,吸干表面水分,观察种胚染色情况。种胚完全着色的是有生活力种子,种胚完全不着色或着色浅、着色面积不超过总面积1/3的为无活力种子[11]。

1.2.4种子萌发特性的测定 常规种子萌发实验。将采集的各种质资源于8月初在中国林业科学研究院温室内进行播种萌发。播种基质为草炭土∶珍珠岩=9∶1(V∶V),与清水混匀后装入50孔规格的黑色育苗穴盘内。各种质随机选取100 粒种球,3次重复,用流水浸种48 h后播种到穴盘中。试验期间保持充分供水,以种子拱出土面5 mm为萌发,观测统计种子初始出苗日期、总出苗天数、出苗持续天数、出苗数。当连续5 d出土幼苗数不超过供试种子粒数1%时视为萌发试验结束,计算种子出苗率。

颖苞对种子萌发的影响。以高出苗率种质OJS-1的种子为试验材料,随后将种子分为两组,一组完整种子不做任何处理;一组用蒸馏水浸泡使其吸胀后,利用解剖刀从种球基部处切断,再利用镊子夹住颖果将其从颖中脱离,最后搓掉稃片得到去颖苞的颖果。

不同溶液处理对种子萌发的影响。以高出苗率种质OJS-1的种子为试验材料,用蒸馏水、0.5%KNO3和GA3三种溶液作为引发剂浸种24 h。具体处理包括:蒸馏水浸种;0.5%KNO3浸种;去颖+蒸馏水浸种;去颖+0.5%KNO3浸种;去颖+1 000 mg·L-1GA3;去颖+1 500 mg·L-1GA3;去颖+2 000 mg·L-1GA3,分别以完整种球和去颖颖果为对照。

将以上处理后的种子均匀播入铺有双层滤纸的培养皿,在培养条件为光照10 h/30℃、黑暗14 h/20℃;湿度40%～60%的人工气候箱中进行发芽试验[12],每个处理设置3次重复,每个重复25 粒种子。以胚根突破种皮作为判断发芽标准,每天记录正常发芽种子数,当连续3 d无种子发芽时萌发试验结束,按照公式计算萌发指标,具体计算方法如下:

1.3 数据统计与分析

2 结果与分析

2.1 野牛草不同种质种子形态特征的分析

野牛草的种球是由花序发育而成的连种性繁殖单位,颜色呈黄褐色,表面光滑、质地坚硬,主体呈圆球形至卵圆形,中间宽两端渐窄,顶端呈毛刺状或芒刺状(图1A)。种球包含颖片、内外稃片和颖果三部分,颖片呈匙状披针形,多个颖片基部合生在最宽处彼此结合,包裹着2～5粒颖果,形成种球的所有颖片统称为颖苞。野牛草的颖果颜色呈红褐色,主体呈半卵圆形,背面拱形、腹面扁平,顶部突起、底部有蒂(图1B)。颖果由种皮、种胚和胚乳三部分组成,种皮表面光亮平滑,紧贴胚乳;胚乳丰富,胚和胚乳呈乳白色。

图1 野牛草种子的形态特征Fig.1 The morphological characteristics of Buchloe dactyloides seeds注:图A,B分别为野牛草种球和颖果的形态结构Note:Panel A and B displayed the morphological structure of seedball and caryopsis,respectively

如图2所示,野牛草不同种质种球长度在4.07～7.49 mm间变化,平均5.66 mm,其中43-3D最长为6.50 mm,7-2A最短为4.54 mm,前者是后者的1.43倍。种球宽度3.27～6.15 mm间变化,平均4.49 mm,其中2A最宽为5.39 mm,60-3最窄为3.71 mm,两者相差0.45倍。种球厚度在1.73～4.34 mm间变化,平均2.85 mm,其中38-2A最厚为3.49 mm,45-1D最薄为2.18 mm,前者是后者的1.60倍。种球长宽比在0.80～2.05间变化,平均为1.27,其中8-4B种球长宽比最大为1.49,表明其种球比较狭长,近长圆柱形;2A种球长宽比最小为1.07,表明其种球近似圆球形。

如图3所示,野牛草不同种质颖果长度在0.92～2.68 mm间变化,平均2.16 mm,其中11-5长度最长为2.38 mm,HC-14长度最短为1.86 mm。颖果宽度变化幅度在1.02～1.79 mm之间,平均1.45 mm,其中42-4宽度最宽为1.69 mm,33-3B和OJS-1宽度最窄为1.24 mm。颖果厚度变化幅度在0.65～1.92 mm间,平均0.89 mm,其中69-5厚度最大为1.01 mm,8-4B,29-2A和34-2A厚度最小为0.79 mm。颖果长宽比的变化范围为0.71～2.18,平均1.51,其中颖果长宽比最大的种质是29-2A;最小的种质是42-4。

图3 野牛草不同种质资源颖果的形态大小Fig.3 Morphological size of the caryopsis of different germplasm resources of B. dactyloide

2.2 野牛草不同种质种子质量特征的分析

如图4所示,野牛草不同种质的颖苞占比在52.92%～85.21%范围内,平均占比为71.26%,其中种质W的颖苞占比最大,高达83.44%;种质67-6A的颖苞占比最小为54.60%。野牛草不同种质种球内颖果的含量在2～5粒之间,其中成熟饱满的颖果平均占比80.57%,种质OJS-1饱满度最大为100%;而种质W饱满度最小为65.93%。

种子千粒重指在自然干燥状态下一千粒种子的重量,是检验种子大小、饱满程度及营养成分的重要指标[13]。由图5可知,野牛草种球千粒重为20.293 g,颖果千粒重为1.940 g,其中OJS-1种球重量最轻为11.507 g,是平均值的0.57倍;38-2A种球重量最重为28.039 g,是平均值的1.38倍;45-1D颖果重量最轻为1.438 g;11-5颖果重量最重为2.467 g。

图5 野牛草不同种质资源种子的千粒重Fig.5 Thousand-grain weight of the seeds of different germplasm resources of B. dactyloide

种子生活力是指种胚的生命力,与种子后期发芽能力有很大联系,是种子品质质量的重要指标之一[14]。TTC染色结果显示(图6),野牛草不同种质种子的平均生活力能达到89.52%,变化范围在82%～100%之间,其中种质11-5,33-3B和OJS-1生活力最强为99.33%;种质W生活力最低为82.67%,表明当年采收的成熟野牛草种子本身生活力较高,具有较强的萌发潜力。

2.3 野牛草不同种质种子形态及质量指标的差异分析

由表2可知,野牛草不同种质种子的形态和质量指标均存在显著差异(P<0.05),表明野牛草种子各性状在不同种质资源间存在明显分化,变异较为丰富。其中野牛草种子形态指标的平均分化系数为10.74%,变异系数由大到小依次为:种球厚度>种球长宽比>颖果长宽比>种球宽度>颖果厚度>种球长度>颖果宽度>颖果长度,总体来看颖果相应指标的变异系数小于种球,说明种球形态大小的变异丰富度高于颖果。野牛草种子质量指标的平均分化系数为10.28%,其中种球和颖果的千粒重分化程度最高,变异系数分别达到了19.22%和13.40%;而种子饱满度和生活力的变异相对较为稳定,变异系数仅为3.91%和5.22%。

2.4 野牛草不同种质种子萌发特性的分析

2.4.1种子初始萌发特性 对50份野牛草种质资源种子的萌发指标进行统计分析(见表3),结果发现不同种质种子的萌发特性存在较大差异。野牛草各种质在播种后3～26 d内陆续出苗,其中种质BISON-A萌动最快,于播种第3 d开始出苗;而种质W出苗最慢,播种第21 d才开始出苗。种子总出苗时间平均25 d,变化幅度在0～38 d之间;出苗持续天数平均18 d,变化幅度在0～34 d之间,其中种质W持续出苗时间最短,从出苗到停止出苗仅历时2 d;种质34-2A持续出苗时间最长,出苗整齐,历时30 d才停止出苗。随着萌发时间的增长,野牛草各种质种子出苗率均呈增加趋势,平均出苗率为6.77%,变异范围在0%～38%之间,其中仅有种质OJS-1出苗率(31.00%)超过20%,由此表明当年采收的野牛草种质资源成熟种球的出苗率比较低,存在明显休眠现象。

2.4.2颖苞对种子萌发指标的影响 如表4所示,带颖种球与去颖颖果的萌发指标存在显著差异(P<0.05)。带颖种球的发芽进程缓慢,第5 d才开始萌动,发芽势为0,萌发结束时的发芽率和发芽指数分别为5.33%和0.37;剥除颖苞后的颖果发芽速度明显增快,萌发第1 d开始破皮露白,第2 d种胚伸长,第3 d达到日萌发高峰期,发芽势为22.67%,萌发结束时的发芽率和发芽指数分别为38.67%和9.57,与带颖苞种球组相比分别提高了6.25倍和24.86倍。由此推测,颖苞结构对野牛草萌动种子萌发产生一定的束缚作用,剥除颖苞后可以明显促进种子萌发。

表4 颖苞对野牛草种子萌发指标的影响Table 4 Effect of glume on seed germination of buffalograss

2.4.3不同溶液处理对种子萌发指标的影响 如图7所示,不同溶液处理对野牛草种子的发芽势影响各不相同。与完整种球相比,0.5%KNO3浸种处理可以显著促进种子发芽势(P<0.05),而蒸馏水浸种未引起种子发芽势的显著提高。与去颖苞的颖果相比,三种溶液浸种处理均能引起种子发芽势的显著提高(P<0.05),其中蒸馏水和0.5%KNO3两种溶液的引发效果相同,两个处理间无显著差异,处理后种子平均发芽势分别为30.67%和33.33%;不同浓度的GA3溶液处理对种子发芽势的促进作用更加突出,随着处理浓度的增加,发芽势呈现上升趋势,并在1 500 mg·L-1处理时达到最大,从去颖苞的颖果的22.67%增加到82.67%(P<0.05)。

图7 不同溶液处理对野牛草种子发芽势的影响Fig.7 Effects of different solution treatments on germination potential of buffalograss seeds注:T1,完整种球;T2,完整种球+蒸馏水浸种;T3,完整种球+0.5%KNO3;T4,去颖;T5,去颖+蒸馏水;T6,去颖+0.5%KNO3;T7,去颖+1 000 mg·L-1GA3;T8,去颖+1 500 mg·L-1GA3;T9,去颖+2 000 mg·L-1GA3。小写字母表示不同处理间的显著水平(P<0.05),下同Note:T1,Whole seedball;T2,Whole seedball soaked into distilled water;T3,Whole seedball soaked into 0.5% KNO3;T4,Mechanical glume removal;T5,Caryopsis soaked into distilled water;T6,Caryopsis soaked into 0.5% KNO3;T7,Caryopsis soaked into 1 000 mg·L-1GA3;T8,Caryopsis soaked into 1 500 mg·L-1GA3;T9,Caryopsis soaked into 2 000 mg·L-1GA3. Different lowercase letters indicate a significant level of difference between treatments (P<0.05),the same as below

通过比较可知,不同溶液处理对野牛草种子的发芽率和发芽指数作用具有一致性(图8,图9)。蒸馏水和0.5%KNO3浸种,完整种球和去颖颖果两类种子的发芽率和发芽指数均显著升高(P<0.05),而对于同一类种子来说蒸馏水处理和0.5%KNO3处理相比效果无显著差异。GA3溶液浸种,去颖颖果的发芽率和发芽指数均随GA3浓度的增加呈现逐渐升高的趋势,2 000 mg·L-1处理使发芽率从去颖颖果(CK)的46.67%增加到94.67%,增加到最高,较CK和1 000 mg·L-1GA3显著升高(P<0.05),发芽指数同样较其它处理也最高,从CK的9.57增加到28.38,但与1 500 mg·L-1GA3处理间无显著差异。

图8 不同溶液处理对野牛草种子发芽率的影响Fig.8 Effects of different solution treatments on germination rate of buffalograss seeds

图9 不同溶液处理对野牛草种子发芽指数的影响Fig.9 Effects of different solution treatments on germination index of buffalograss seeds

2.5 野牛草种子性状指标的相关性分析

如表5所示为50份野牛草种质资源种子生物学性状间的Pearson Correlation相关性分析,结果发现野牛草种子各性状间存在广泛的相关性。在形态指标中,种球长度、宽度和厚度间存在极显著正相关(P<0.01),种球长宽比与宽度、厚度存在极显著负相关(P<0.01),相关系数为-0.72和-0.52,说明种球的形状大小主要取决于其宽度和厚度;颖果宽度与厚度呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.69,颖果长宽比与长度呈极显著正相关(P<0.01),相关系数为0.53,与宽度和厚度呈极显著负相关(P<0.01),相关系数为-0.72和-0.48,说明颖果长度越长其形状越接近于长卵形;颖果宽厚度越大其形状越接近于圆球形。

表5 野牛草种子生物学性状的相关性分析Table 5 Correlation analysis of biological characters of buffalograss seeds

在质量指标中,颖苞占比与种球千粒重呈极显著正相关(P<0.01),与颖果千粒重呈极显著负相关(P<0.01),说明颖苞是种球组成的主要部分,其重量决定了种球总重量;颖果千粒重与饱满度、生活力呈极显著正相关(P<0.01),说明颖果大小是决定种子质量优劣的关键;种子形态质量指标与发芽能力也存在紧密联系,其中出苗率与颖果长度呈显著正相关关系(P<0.05),与颖果千粒重、饱满度、生活力呈极显著正相关关系(P<0.01),与颖苞占比呈极显著负相关关系(P<0.01),表明颖果质量是保障种子发芽能力的关键,而颖苞是阻碍种子发芽的重要因素。

2.6 野牛草不同种质资源的聚类分析

依据8个种子形态指标进行聚类,结果发现在欧氏距离为18时,50份野牛草种质资源被划分为3个类群(图10A)。第I类包括11-5,2-2B,2A,38-2A,W等11份种质,占比22%,该类群的种球长(6.01 mm)、宽(5.03 mm)、厚(3.20 mm)均最大;种球长宽比最小为1.21,表明其种球大小最大,形状偏圆接近于圆球形。第II类包括5份种质材料,分别为7-2A,48-5,45-1D,60-3和29-2A,占比10%,该类群的种球和颖果长、宽、厚均处于中间水平,形状偏长圆柱形。第III类包括46-2B,HC-15,33-2A,70-3A,BISON-A,47-1B等34份种质,占比69%,其颖果宽(1.46 mm)、厚(0.90 mm)最大,表明其颖果最大;颖果长宽比最小为1.49,表明其颖果形状偏长椭圆形。

图10 50份野牛草种质资源的聚类分析Fig.10 Cluster analysis of 50 buffalograss germplasm resources注:A图为依据野牛草种子形态指标进行的聚类分析;图B依据野牛草种子质量指标进行的聚类分析Note:Panel A displays the clustering based on seed morphological indexes;Panel B the clustering based on seed quality indicators

依据5个种子质量指标进行聚类,结果发现在欧氏距离为12.5时,50份野牛草种质资源被划分为3个类群(图10B)。第I类群包括30-3A,73-4A,29-2A,67-6A,BISON-A,33-3B和OJS-1总共7份材料,该类群的种球千粒重最低为16.02 g,颖苞占比最低为59.32%;饱满度最高为94.14%,生活力最强为96.95%。第II类群包括33-2A,11-5,34-2A,40-1B,42-4等总共37份材料,该类群的种球千粒重最大为21.21 g;种子比较饱满,饱满度为83.91%;生活力也比较强为88.90%。第III类群包括68-3B,W,8-4B,37-7B,65-3B和63-5B总共6份种质,该类群的种球千粒重为19.64 g,颖苞占比最高为77.99%;种子饱满度和生活力最低分别为69.30%和84.67%。

3 讨论

种子作为植物遗传信息的保存者与传递者,其生物学特性是为保证物种繁衍在环境变化过程中形成的一种适应性性状,受到遗传因素和环境因素共同的调控,是培育优良品种的重要基础[15]。本研究中野牛草不同种质资源在相同管理条件下生长,研究其生物学特性可以深入了解野牛草种子的遗传多样性,对种质资源的鉴定、收集、创新以及良种繁育具有重要意义[16]。

变异系数主要反映生物学性状的变异程度,变异系数值越大,其性状在种质间的差异越大,对种质创新的贡献率越高[17]。本研究结果表明,野牛草种子的形态结构特异,是由聚合生长的颖片组成的球状颖苞结构,保护了种子活力长期存在,使物种得以延续;野牛草种子形态大小和质量指标在不同种质间均存在明显差异,其中种球宽厚、种球长宽比、颖果长宽比、种子千粒重在各种质中差异较大,变异系数均高于11%,说明这些性状具有较丰富的遗传多样性,蕴藏着较大的筛选潜力[18];而种子饱满度、生活力在种质遗传过程中变异稳定,变异系数低于6%,难以通过选育的方法进行改良。

聚类分析是将类似对象组成不同类别的分析过程,可以反映各类群的特点及种质间的遗传差异,是植物选育的重要方法之一[19]。本研究根据形态相关指标进行聚类,筛选出第I类群11份种球个头最大,形状近于圆球形种质,以及第III类群34份颖果最大,形状偏长椭圆形种质;根据质量相关指标进行聚类,筛选出第I类群7份饱满度高、生活力强等性状表现优良的种质,为优良育种亲本或栽培材料的选择提供参考。

种子萌发是植物实现物种更新和延续的关键,而种子生活力是种子萌发的生理基础,具有活力的种子才有发芽潜力[20]。本研究通过TTC染色检测发现,野牛草不同种质种子本身均有较高生活力,且生活力与出苗率呈极显著正相关,表明生活力越强,发芽潜能越大,播种效果越好。但有活力的种子不一定都能萌发,若在适宜环境条件下不能正常萌发说明该种子处于休眠状态[21]。因此种子萌发指标可以衡量种子的休眠特性,通常休眠性弱的种子在收获后短时间内便能萌发,而休眠性强的种子未经处理萌发率低、出苗晚[22]。本研究供试野牛草不同种质种子萌发指标差异显著,平均萌发周期长,而萌发持续期短,平均8 d左右开始出苗,且出苗不整齐,自然出苗率小于10%,明显小于自身生活力,说明当年采收的野牛草不同种质种子本身存在不同程度的休眠特性。

种子休眠在植物中普遍存在,是植物长期保存其较强活力,抵抗环境及季节变化的适应性机制,对于物种的延续繁衍具有普遍生态学意义[23]。种子休眠是一个非常复杂的现象,造成休眠的原因有很多,因此不同植物其休眠特性也不尽相同,Nikolaeva根据诱发休眠部位不同,建立了以外源休眠、内源休眠和组合休眠为主的综合分类系统[24]。本研究中带颖苞种球和去颖苞颖果的萌发指标存在明显差异,剥除颖苞结构可以显著促进种子萌发,解除部分种子的休眠,表明颖苞结构是抑制野牛草种子萌发的外源因素,但不是种子产生休眠的唯一因素,内部还存在其它因素影响种子萌发,该结果同李德颖等[25-26]研究一致。不同溶液处理颖果研究表明,与蒸馏水和0.5%KNO3浸种相比,经过GA3引发野牛草种子萌发的效果更显著,尤其以2 000 mg·L-1浓度为最佳,种子休眠基本上完全解除,说明种子内部萌发抑制物在GA3处理下进行了转化从而休眠解除,但种子休眠与萌发的具体机制还有待进一步探索。

4 结论

本研究中的50份野牛草种质资源种子的生物学特性具有丰富的变异,形态特征和质量特性之间具有广泛相关性。其中,基于质量指标聚类筛选出7份性状表现优良的种质资源,可为新品种的培育提供材料。当年采收的野牛草各种质资源种子本身具有较高生活力,但自然萌发率低,存在不同程度的休眠特性。剥除颖苞结构是打破野牛草种子休眠的前提,但颖苞不是抑制种子萌发的唯一因素,去颖苞的颖果还需引发剂才能大幅度促进种子萌发,其中剥除颖苞结合GA3引发的破眠效果最好,且以2 000 mg·L-1的GA3浓度为最佳,种子子休眠基本可以完全解除。