唐晓旭，张志乾，李福琴，王 楠

（1.郑州澍青医学高等专科学校临床医学系，郑州 450064；2.河南省洛阳正骨医院脊柱外科，郑州 457000；3.郑州大学第一附属医院感染管理科，郑州 450052；4.郑州大学第一附属医院急诊外科，郑州 450052）

胫骨骨折是临床常见的四肢骨折类型，多由高能量暴力引起，容易造成局部软组织及血供的破坏，进而增加内固定手术后骨折不愈合或延迟愈合的发生风险［1－2］。 骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）在骨折愈合过程中发挥重要作用，骨折断端趋化和浸润的BMSCs 能够发生成骨分化，进而促进骨质形成、加速骨折愈合［3］；BMSCs 的浸润及成骨分化受阻时，对骨折愈合产生不利影响［4］。 BMSCs 成骨分化的影响因素复杂，通过有效的干预手段促进BMSCs 的成骨分化有助于增强BMSCs 在骨折愈合中的作用。

近些年，基因治疗在干细胞成骨分化、骨折愈合中的应用备受关注，解整合素金属蛋白酶10（a disintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）基因的编码产物定位于细胞膜，在调控细胞黏附、运动、分化中均起到作用［5－7］。 一项口腔科相关的研究证实在牙周膜干细胞成骨分化过程中ADAM10 的表达逐步降低，通过慢病毒感染的方式进行ADAM10 过表达对牙周膜干细胞的成骨分化具有抑制作用且这一作用与抑制Notch1 信号通路有关［8］，但该基因在BMSCs 成骨分化中的作用及其在骨折愈合中的潜在效应尚不清楚。 因此，本实验通过稳定敲低ADAM10 表达的细胞实验及胫骨骨折的动物实验分析ADAM10 基因对BMSCs 成骨分化及胫骨骨折愈合的影响，同时也分析Notch1 信号通路在ADAM10基因调控BMSCs 成骨分化及胫骨骨折愈合中的作用，旨在深入认识BMSCs 成骨分化的调控机制，发现促进胫骨骨折愈合的新治疗靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF 级雄性SD 大鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司［SCXK（沪）2018－0004］，共20 只，8 ～10周龄，体重180～200 g，实验动物于郑州澍青医学高等专科学校动物房饲养［SYXK（豫）2022－0004］，温度20～22℃，湿度50%～55%，12 h／12 h 光照／黑暗交替，自由饮食摄水。 实验经郑州市澍青医学高等专科学校医学伦理委员会批准（2021KYLL-Y-019），动物实验遵循3R 原则。

1.1.2 细胞

SD 大鼠BMSCs（货号：RASMX-01001）购自广州赛业生物科技有限公司。

1.2 主要试剂与仪器

阴 性对 照（negative control，NC） shRNA 及ADAM10 shRNA 的pGFP-V-RS 载体、NC shRNA 及ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 载体（北京傲锐东源生物公司）；转染试剂Lipo2000（美国Invitrogen 公司，批号：11668027）；地塞米松（批号：D1756）、β-甘油磷酸钠（批号：G6251）、维生素C（批号：A7506）、茜素红（批 号： A5533）、 Notch1 激动 剂丙戊 酸（Valproic acid，VPA） （批号：P4543） （储存液用DMSO 配置、浓度1.0 mol／L）（美国Sigma 公司）；碱性磷酸酶（ALP）活力检测试剂盒（北京索莱宝公司，批号：BC2145）；HE 染色试剂盒（上海碧云天公司，批号：C0105）；ADAM10（批号：ab124695）、骨钙素（osteocalcin，OCN）（批号：ab133612）、Runt 相关转录因子2 （Runt-related transcription factor 2，Runx2）（批号：ab76956）、I 型胶原（Type I collagen，Col-I）（批号：ab34710）、Notch 受体胞内部分（Notch intracellular domain，NICD）（批号：ab52627）、发状分裂相关增强子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）（批号：ab108937）的特异性一抗（美国Abcam 公司）。 HERAcell 150i 型细胞培养箱（美国Thermo 公司）；Tanon4800 型凝胶成像系统（上海天能仪器公司）；VISION90 型小动物科研X 光机检测仪（丹东奥龙射线仪器集团有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞实验

BMSCs 在完全培养基中贴壁培养，消化传代后接种在培养皿内进行分组转染，转染5 mg／L NC shRNA 的pGFP-V-RS 载体、5 mg／L ADAM10 shRNA的pGFP-V-RS 载体，48 h 后更换为含有1 g／L 嘌呤霉素的筛选培养基，筛选得到稳定转染的BMSCs。

稳定转染的BMSCs 分组：为验证ADAM10 的调控作用，不进行转染的BMSCs 作为对照组，稳定转染NC shRNA 的BMSCs 作为sh-NC 组、稳定转染ADAM10 shRNA 的BMSCs 作为sh-ADAM10 组；为验证Notch1 在ADAM10 发挥调控作用中的生物学意义，稳定转染NC shRNA 的BMSCs 加入体积分数0.1%的DMSO 作为sh-NC ＋DMSO 组，稳定转染ADAM10 shRNA 的BMSCs 加入体积分数0.1%的DMSO 作 为 sh-ADAM10 ＋DMSO 组， 稳 定 转 染ADAM10 shRNA 的BMSCs 加入终浓度1.0 mmol／L的VPA 作为sh-ADAM10＋VPA 组。

各组BMSCs 按照1×105个／孔加入6 孔培养板，待细胞密度达到约80%后更换为含有0.1 μmol／L 地塞米松、10 mmol／L β-甘油磷酸钠、50 mg／L 维生素C、10%胎牛血清的成骨诱导培养基，每2 d 更换1 次培养基，连续进行成骨诱导14 d。

1.3.2 动物分组、造模及给药

SD 大鼠随机分为sh-NC 组和sh-ADAM10 组，每组各10 只，均参照文献［9］进行胫骨骨折造模，方法如下：腹腔注射2%戊巴比妥钠、30 mg／kg 麻醉，在左下肢前外侧、胫骨中上1／3 处做纵行切口，显露胫骨骨干，手术刀来回横截造成骨折，术中能够明显听到骨头断裂的裂纹声且术后进行胫骨X 线摄片检查、出现骨折线判断为造模成功。 用长度17 mm 的克氏针固定骨折的胫骨，完成造模后在骨折局部进行pCMV5.0 载体的注射。 sh-NC 组注射5 mg／kg NC shRNA 的pCMV5.0 载体、sh-ADAM10 组注射5 mg／kg ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 载体，4周后评价骨折愈合情况。

1.3.3 细胞的茜素红染色

成骨诱导14 d 时，收集细胞并在0.1%茜素红中染色30 min，在显微镜下观察茜素红阳性染色的钙结节，拍照记录后每孔加入10%氯化十六烷基吡啶500 μL，充分震荡使钙结节溶解，将50 μL 液体移入96 孔培养板的培养孔内，在酶标仪上检测405 nm 的波长值。

1.3.4 细胞ALP 活性的检测

成骨诱导14 d 时，收集细胞并采用细胞ALP 活性检测试剂盒进行实验，裂解细胞后分别检测ALP活性（以U／L 表示）及蛋白浓度（以mg／L 表示），计算每mg 蛋白对应的ALP 活性。

1.3.5 细胞及组织中蛋白表达的检测

收集成骨诱导14 d 时的BMSCs 和胫骨骨折处骨组织，加入裂解液后进行细胞裂解或组织匀浆，提取得到蛋白后检测浓度，将含有30 μg 蛋白样本用于Western blot 检测，电泳、电转PVDF 膜、5%脱脂牛奶室温封闭1 h 后4℃孵育1 ∶1000 稀释的ADAM10、OCN、Runx2、Col-I、NICD、Hes1 一抗或1 ∶5000 稀释的β-actin 一抗过夜。 次日，室温孵育二抗1 h，最后在凝胶成像仪中显影得到蛋白条带，根据条带的灰度值、以β-actin 为内参，计算ADAM10、OCN、Runx2、Col-I、NICD、Hes1 的表达水平。

1.3.6 骨折愈合的评价

首先采用VISION90 型小动物科研X 光机检测仪进行X 线检查，观察骨折局部的影像学变化；而后收集胫骨骨折处的骨组织，4%多聚甲醛固定后制作组织蜡块及病理切片，采用HE 染色试剂盒完成染色操作，封片后在显微镜下观察骨折局部的骨痂及骨小梁特征。

1.4 统计学方法

采用SPSS 23.0 软件对实验数据进行统计学处理，计量资料以平均数±标准差（±s）表示，组间比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMSCs 成骨诱导后不同时间点ADAM10 表达水平的比较

BMSCs 成骨诱导后不同时间点ADAM10 表达水平的比较均有统计学差异（P＜0.05），随着成骨诱导时间延长，BMSCs 中ADAM10 的表达水平呈逐步降低趋势，提示在BMSCs 成骨分化的过程中ADAM10 的表达受到抑制。 见图1。

注：与诱导0 d 时比较， *P＜0.05；与诱导7 d 时比较， ＆P＜0.05。图1 BMSCs 成骨诱导后不同时间点ADAM10表达水平的比较Note.Compared with 0 d of induction， *P＜0.05.Compared with 7 days after induction， ＆P＜0.05.Figure 1 Comparison of ADAM10 expression levels at different time points after osteogenesis induction of BMSCs

2.2 不同转染组BMSCs 中ADAM10 表达水平的比较

对照组与sh-NC 组BMSCs 中ADAM10 表达水平的比较无显著差异（P＜0.05）；sh-ADAM10 组BMSCs 中ADAM10 表达水平均低于对照组和sh-NC组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明稳定转染sh-ADAM10 使BMSCs 中ADAM10 表达降低。 见图2。

注：与对照组比较， *P＜0.05；与sh-NC 组比较， ＆ P＜0.05。图2 不同转染组BMSCs 中ADAM10 表达水平的比较Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh0NC group， ＆P＜0.05.Figure 2 Comparison of ADAM10 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.3 抑制ADAM10 表达对BMSCs 成骨分化的影响

sh-ADAM10 组BMSCs 成骨诱导后茜素红染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均高于对照组和sh-NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明敲低ADAM10 表达促进BMSCs 的成骨分化。 见图3。

注：A：茜素红染色；B：405 nm 吸光值的比较； C：LP 活性的比较。 与对照组比较， *P＜0.05；与sh-NC 组比较， ＆P＜0.05。图3 不同转染组BMSCs 中ADAM10 表达水平的比较Note.A， Alizarin red staining.B， Comparison of absorbance at 405 nm.C， Comparison of ALP activity.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 3 Comparison of ADAM10 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.4 抑制ADAM10 表达对BMSCs 成骨诱导后成骨标志基因表达的影响

sh-ADAM10 组BMSCs 成骨诱导后OCN、Runx2、Col-I 的表达水平均高于对照组和sh-NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明敲低ADAM10表达促进BMSCs 中成骨标志基因的表达。 见图4。

注：与对照组比较， *P＜0.05；与sh-NC 组比较， ＆P＜0.05。图4 不同转染组BMSCs 中OCN、Col-I 和Runx2 表达水平的比较Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 4 Comparison of OCN， Col-I and Runx2 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.5 抑制ADAM10 表达对BMSCs 成骨诱导后Notch1 通路的影响

sh-ADAM10 组BMSCs 成骨诱导后NICD、Hes1的表达水平均低于对照组和sh-NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明敲低ADAM10 表达抑制BMSCs 中Notch1 信号通路的激活。 见图5。

注：与对照组比较， *P＜0.05；与sh-NC 组比较， ＆P＜0.05。图5 不同转染组BMSCs 中NICD、Hes1 表达水平的比较Note.Compared with the control group， *P＜0.05.Compared with sh-NC group， ＆P＜0.05.Figure 5 Comparison of NICD， Hes1 expression levels in BMSCs among different transfection groups

2.6 Notch1 通路激动剂VPA 对抑制ADAM10 表达促进BMSCs 成骨分化的影响

sh-ADAM10＋DMSO 组BMSCs 成骨诱导后茜素红染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均高于sh-NC＋DMSO 组（P＜0.05）；sh-ADAM10 ＋VPA 组BMSCs成骨诱导后茜素红染色的405 nm 吸光值、ALP 的活性均低于sh-ADAM10＋DMSO 组（P＜0.05），表明激活Notch1 通路使敲低ADAM10 表达促进BMSCs 成骨分化的作用减弱。 见图6。

注：A：茜素红染色；B：405 nm 吸光值的比较；C：ALP 活性的比较。 与sh-NC＋DMSO 组比较， *P＜0.05；与sh-ADAM10＋DMSO 组比较， ＆P＜0.05。图6 Notch1 通路激动剂VPA 对抑制ADAM10 表达促进BMSCs 成骨分化的影响Note.A， Alizarin red staining.B， Comparison of absorbance at 405 nm.C， Comparison of ALP activity.Compared with the sh-NC＋DMSO group， *P＜0.05.Compared with sh-ADAM10＋DMSO group， ＆P＜0.05.Figure 6 Effect of Notch1 pathway agonist VPA on the inhibition of ADAM10 expression promoting osteogenic differentiation of BMSCs

2.7 Notch1 通路激动剂VPA 对抑制ADAM10 表达促进BMSCs 中成骨标志基因表达的影响

sh-ADAM10＋DMSO组BMSCs成骨诱导后OCN、Runx2、Col-I 的表达水平均高于sh-NC＋DMSO 组（P＜0.05）；sh-ADAM10 ＋VPA 组BMSCs 成骨诱导后OCN、Runx2、Col-I 的表达水平均低于sh-ADAM10＋DMSO 组（P＜0.05），表明激活Notch1 通路使敲低ADAM10 表达促进BMSCs 中成骨标志基因表达的作用减弱。 见图7。

注：与sh-NC＋DMSO 组比较， *P＜0.05；与sh-ADAM10＋DMSO 组比较， ＆P＜0.05。图7 Notch1 通路激动剂VPA 对抑制ADAM10 表达促进BMSCs 中成骨标志基因表达的影响Note.Compared with the sh-NC＋DMSO group， *P＜0.05.Compared with sh-ADAM10＋DMSO group， ＆P＜0.05.Figure 7 Effect of Notch1 pathway agonist VPA on the inhibition of ADAM10 expression promoting osteogenic marker genes expression of BMSCs

2.8 抑制ADAM10 表达对大鼠胫骨骨折愈合的影响

经X 射线检查，sh-NC 组胫骨骨折大鼠的骨折线清晰，sh-ADAM10 组胫骨骨折大鼠的骨折线几乎消失；经HE 染色，sh-NC 组大鼠的骨痂纤维较多、成熟的小梁骨较少，sh-ADAM10 组大鼠的骨痂明显增多、且形成成熟的小梁骨，表明敲低ADAM10 表达促进胫骨骨折愈合。 见图8。

注：A：胫骨骨折的X 射线检查，箭头所指为骨折线；B：胫骨骨折的HE 染色。图8 抑制ADAM10 表达对大鼠胫骨骨折愈合的影响Note.A， X-ray examination of tibial fracture.B， HE staining of tibial fracture.Figure 8 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on tibial fracture healing in rats

2.9 抑制ADAM10 表达对大鼠胫骨骨折中成骨标志基因表达的影响

sh-ADAM10 组胫骨骨折大鼠骨折部位中OCN、Runx2、Col-I 的表达水平均高于sh-NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），结果表明敲低ADAM10 表达促进胫骨骨折愈合过程中的成骨标志基因表达。见图9。

注：与sh-NC 组比较， *P＜0.05。图9 抑制ADAM10 表达对大鼠胫骨骨折中成骨标志基因表达的影响Note.Compared with the sh-NC group， *P＜0.05.Figure 9 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on osteogenic marker genes expression in rat tibia fracture

2.10 抑制ADAM10 表达对大鼠胫骨骨折中Notch1 通路的影响

如图10所示，sh-ADAM10组胫骨骨折大鼠骨折部位中NICD、Hes1 的表达水平均低于sh-NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），表明敲低ADAM10表达促进胫骨骨折愈合过程中Notch1 信号通路的激活。

注：与sh-NC 组比较， *P＜0.05。图10 抑制ADAM10 表达对大鼠胫骨骨折中Notch1 通路的影响Note.Compared with the sh-NC group， *P＜0.05.Figure 10 Effect of the inhibition of ADAM10 expression on Notch1 pathway in rat tibia fracture

3 讨论

胫骨骨折多由交通事故、高处坠落等高能量暴力引起，胫骨局部存在软组织薄弱、穿支血管少的解剖特点，高能量暴力容易引起局部软组织缺损及血供损害，进行切开复位内固定治疗后的不愈合或延迟愈合发生风险较高。 国内葛向荣等［10］和赵国平等［2］的临床研究分别报道胫骨骨折后延迟愈合的发生率为34.31%和27.16%。 骨折延迟愈合或不愈合不仅影响肢体功能、降低生活质量，还增加二次手术风险、加大经济负担，因此需要进行积极防治［11－12］。 本研究通过细胞实验和动物实验分析了ADAM10 基因对BMSCs 成骨分化及胫骨骨折愈合的影响。

ADAM10 的主要生物学功能是对各种细胞因子及受体、结构蛋白实现剪切，进而调控不同的生物学过程［5－7］。 本研究对BMSCs 进行成骨诱导分化，在分化过程中ADAM10 的表达水平也呈逐步降低趋势，与朱永翠等［8］的研究结果一 致。 为了验证ADAM10 基因在BMSCs 成骨分化中的调控作用，本研究在成骨诱导前先构建了稳定转染pGFP-V-RS载体的BMSCs，而后进行成骨诱导分化并检测，结果显示，敲低ADAM10 表达使BMSCs 成骨诱导分化后的钙结节数量及ALP 活性均明显增加。 干细胞的成骨分化过程涉及多种标志基因的变化，Col-I 和OCN 分别是骨基质中主要的胶原成分和非胶原成分，Runx2 是调控成骨分化的关键基因［13－14］，本研究在稳定敲低ADAM10 的BMSCs 进行成骨诱导后检测到Col-I、OCN、Runx2 的表达水平增加，与成骨诱导后钙结节数量及ALP 活性增加的结果吻合。以上结果表明敲低ADAM10 基因显著抑制BMSCs的成骨分化。

根据朱永翠等［8］的研究，ADAM10 对牙周膜干细胞中Notch1 通路具有调控作用。 Notch1 通路在成骨分化及骨折愈合中起重要作用，有研究报道抑制Notch1 通路对干细胞的成骨分化具有促进作用，在骨折愈合过程中Notch1 表达下调是骨形成的必备条件［15－16］。 Notch1 是一类膜受体，与配体结合后通过三次酶切反应将胞内结构域NICD 释放进入胞浆，作用与Hes1 并调控细胞增殖及分化。 ADAM10具有水解细胞膜受体胞内或胞外结构域的功能，多项研究证实ADAM10 能够水解Notch1 的胞内结构域并产生NICD［17－19］。 本研究在稳定敲低ADAM10的BMSCs 进行成骨诱导后检测到NICD 及Hes1 的表达均明显降低，在成骨诱导的过程中持续给予Notch1 激动剂VPA 干预后、稳定敲低ADAM10 促进成骨分化的作用被削弱，表明敲低ADAM10 促进成骨分化的作用与抑制Notch1 通路有关。

在胫骨骨折的愈合过程中，BMSCs 在骨折局部迁移、浸润并发生成骨分化对新骨形成具有重要意义。 为了更深入认识ADAM10 基因调控BMSCs 成骨分化在胫骨骨折愈合中的生物学意义，本研究建立了胫骨骨折大鼠模型，在骨折局部注射ADAM10 shRNA 的pCMV5.0 载体以敲低ADAM10，通过观察骨折愈合情况可知：敲低ADAM10 后加速了胫骨骨折的愈合，骨折部位的骨折线几乎消失且胶原形成、ALP 活性及OCN、Runx2、Col-I 的表达水平均明显增加，同时还观察到Notch1 通路中NICD、Hes1 的表达降低。 以上动物实验结果与干细胞实验的结果吻合，表明敲低ADAM10 显著促进胫骨骨折的愈合。

综上所述，本研究通过细胞实验及动物实验证实敲低ADAM10 促进BMSCs 的成骨分化及胫骨骨折的愈合，这一促进作用与抑制Notch1 通路有关，这为今后胫骨骨折后不愈合及延迟愈合的防治提供了新思路。