赵泽满，吴育朔，刘雅涵，矫政洧，蔡思源，靳小石

1 河北大学临床医学院，河北保定071000；2 河北大学附属医院普通外科；3 河北大学附属医院门诊部

炎症性肠病（IBD）是一种以慢性、复发性肠道炎症为特征的疾病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，可累及肠道的任何部分，临床上常表现为腹痛、腹泻、血便、体质量减轻等，还会导致严重并发症［1］。SLC5A8基因作为被发现的SLC5基因家族中的第8个成员，其编码的蛋白是与钠离子耦联转运短链脂肪酸（SCFAs）高亲和力转运体，在结肠、回肠中大量表达［2］。SCFAs能通过SLC5A8调控的转运蛋白进入结肠上皮细胞内，参与免疫调节，因此推测SLC5A8可能通过免疫调控参与了IBD的发生。2022年1—10月，本研究观察了SLC5A8基因过表达后，脂多糖诱导的IBD细胞模型结构及IL-8、TGF-β1水平变化，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要材料 人正常结肠上皮细胞FHC由某附属医院中心实验室馈赠，置于含10%胎牛血清+1%青—链霉素的RPMI1640培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。脂多糖购自北京索莱宝科技有限公司，RPMI1640培养基、青—链霉素溶液购自大连美仑生物技术有限公司，TRIzol Universal总RNA提取试剂购自TIANGEN公司，HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，RT-qPCR引物购自上海生工生物工程股份有限公司，SLC5A8过表达质粒购自苏州吉玛基因股份有限公司，Human IL-8 ELISA Kit、Human/Mouse/Rat TGF-β1ELISA Kit购自联科生物技术有限公司。实时荧光定量PCR仪为Applied Biosystems公司产品。

1.2 细胞分组与模型制作 将FHC细胞分为对照组、模型组及实验组。对照组转染pcDNA3.1-GFP空载质粒；模型组转染pcDNA3.1-GFP空载质粒，再加100 μg/mL脂多糖刺激24 h；实验组转染SLC5A8基因过表达质粒，再加100 μg/mL脂多糖刺激24 h。

1.3 细胞结构观察 弃去细胞上清液，剩余细胞用PBS清洗（2 mL），重复2次；用电镜固定液固定细胞，保存于4 ℃冰箱，透射电镜下观察三组细胞结构。

1.4 细胞及培养液上清中IL-8、TGF-β1检测 提取各组FHC细胞总RNA并反转录为cDNA，采用RT-qPCR法检测IL-8、TGF-β1mRNA。以TBP作为内参。TBP上游引物序列为5′-TGTATCCACAGTGAATCTTGGTTG-3′，下游引物序列为5′-GGTTCGTGGCTCTCTTATCCTC-3′；IL-8基因上游引物序列为5′-GAGAGTGATTGAGAGTGGACCAC-3′，下游引物序列为5′-CACAACCCTCTGCACCCAGTTT-3′；TGF-β1基因上游引物序列为5′-TACCTGAACCCGTGTTGCTCTC-3′，下游引物序列为5′-GTTGCTGAGGTATCGCCAGGAA-3′。PCR 反应条件：预变性95 ℃ 30 s；95 ℃ 3～10 s，60 ℃ 10～30 s，共40个循环；溶解95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以2－ΔΔCt表示目的基因相对表达量。取细胞上清液入离心管，离心机离心（2 600 r/min，10 min）去除沉淀物。采用ELISA法检测细胞培养液上清中的IL-8、TGF-β1，按试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法 采用SPSS26.0软件进行统计分析，GraphPad Prism9.4软件作图。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用最小显著性差异法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞结构改变 对照组细胞膜表面微绒毛无断裂，无脱落，紧密连接结构致密呈带状；模型组细胞膜表面微绒毛变稀疏，脱落，紧密连接的细胞间隙增宽；实验组细胞膜表面存在微绒毛脱落，紧密连接结构部分破坏。见图1。

图1 各组细胞结构变化

2.2 各组细胞及培养液上清中IL-8、TGF-β1表达比较 与对照组相比，模型组IL-8 mRNA表达及培养液上清中IL-8水平升高，TGF-β1mRNA表达及培养液上清中TGF-β1水平降低（P均＜0.01）；与模型组相比，实验组IL-8 mRNA表达及培养液上清中IL-8水平降低，TGF-β1mRNA表达及培养液上清中TGF-β1水平升高（P均＜0.01）。见表1。

表1 各组细胞及培养液上清中IL-8、TGF-β1表达比较（）

表1 各组细胞及培养液上清中IL-8、TGF-β1表达比较（）

注：与对照组相比，*P＜0.01；与模型组相比，#P＜0.01。

组别实验组模型组对照组TGF-β1 1.21 ± 0.05#0.30 ± 0.04*1.00 ± 0.03 IL-8 mRNA 1.20 ± 0.10#2.46 ± 0.13*1.00 ± 0.05 IL-8 0.70 ± 0.01#2.29 ± 0.00*1.00 ± 0.01 TGF-β1 mRNA 1.40 ± 0.11#0.72 ± 0.06*1.00 ± 0.05

3 讨论

调查显示，IBD发病率在世界范围内呈持续增高趋势［3］。IBD发病机制复杂，病因仍不十分清楚，所以需要对IBD机制做更加深入的研究。SIVAPRAKASAM等［4］的研究显示，IBD是由于宿主免疫系统和微生物群之间的共生关系被破坏而导致肠道慢性炎症，各种因素会改变肠道微生物群，导致肠道菌群生态失调，其中以饮食和膳食纤维两个因素较为关键。

SLC5A8可通过影响黏膜免疫系统的耐受反应从而调节肠道稳定。有研究表明，SLC5A8基因通过影响结肠组织与肠系膜淋巴结中的CD4+T淋巴细胞来调节机体免疫［5］。CD4+T淋巴细胞可通过分泌IL-10、IL-8及IL-12等因子影响IBD的发生和发展［6-7］。SLC5A8基因的表达产物是Na+-单羧酸偶联转运蛋白，其主要功能将细菌发酵的短链脂肪酸（SCFA）转运到细胞内发挥作用。Na+-单羧酸偶联转运蛋白在肠道黏膜组织、尤其是在丁酸含量较高的结肠黏膜组织中含量最多。SCFA主要是由细菌在结肠中发酵膳食纤维并产生，主要包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，它们不仅可以作为结肠细胞能量来源，还具有抑制免疫细胞活化的功能，其中以丁酸盐的抗炎效果最为明显［8-10］。丁酸可以通过SLC5A8转运体进入细胞，然后通过促进抗炎因子表达及抑制促炎因子表达发挥抗炎作用［11］。IBD患者由于肠道环境失调，影响了丁酸的产生、氧化和吸收［12］。本研究实验组利用脂多糖构建IBD细胞模型后，再转染过表达SLC5A8质粒，发现炎症因子表达呈下降趋势，抗炎因子表达呈上升趋势。因此，我们推测SLC5A8基因可能参与抑制IBD的发生发展。

肠道黏膜损伤是IBD患者的主要特征之一，所以促进肠道黏膜愈合可能成为减轻IBD患者临床症状、抑制疾病复发的新方向［13］。肠道黏膜损伤的出现预示着肠上皮屏障破坏。肠黏膜愈合是由上皮细胞增殖和分化完成的，巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等免疫细胞共同参与调节［14］。本研究透射电镜观察发现，实验组与模型组相比，细胞膜表面微绒毛脱落减少，紧密连接结构破坏较少。可以推测出SLC5A8基因可能通过维持肠道黏膜的完整性，保护IBD肠道黏膜。

IL-8作为一种促炎细胞因子，通过介导多种信号通路，在许多炎症性疾病包括IBD中发挥着重要作用，同时也参与了结直肠癌的发生发展［15-16］。WALANA等［17］应用IL-8拮抗剂G31P治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型，显著减低了血清IL-8水平，上调紧密连接蛋白表达，抑制了炎症的发展，减轻了结肠纤维化。本研究结果显示，实验组细胞中IL-8 mRNA表达及培养液上清中IL-8水平低于模型组，推测SLC5A8基因可能通过抑制IL-8的表达来干预IBD。

人体肠黏膜系统中存在着多种的免疫细胞亚群，其活性受到细胞因子调节，其中包括TGF-β1［18］。TGF-β1是一种由多种类型细胞产生的具有多重效应的细胞因子，可控制肠黏膜免疫细胞和非免疫细胞的活化、生长、增殖和分化。TGF-β1可促进调节性T细胞、辅助性T细胞（Th）17和Th9分化的能力，从而在一些炎症性疾病中发挥作用［19］。炎症T淋巴细胞及其相关促炎细胞的积累是IBD患者的显著特征之一，与IBD的发生发展密切相关［20］。本研究中实验组细胞TGF-β1mRNA表达及培养液上清TGF-β1水平上调，提示SLC5A8基因干预IBD的机制可能还与上调TGF-β1分泌、进一步影响T细胞免疫有关。

综上所述，SLC5A8基因过表达有助于维持IBD细胞模型的结构，抑制炎症细胞因子IL-8表达，促进抗炎细胞因子TGF-β1表达，从而有助于减轻IBD的炎症反应。以上研究结果为IBD的治疗提供了新的思路及实验依据。