高效液相色谱法同时测定摩罗丹中5 种成分含量

2023-12-01张汶婕

中国药业 2023年22期

张汶婕，宗镇，吴陵

（安徽省铜陵市食品药品检验中心，安徽铜陵 244000）

摩罗丹（分蜜丸与浓缩丸）由百合、茯苓、玄参等18味中药制成，有和胃降逆、健脾消胀、通络定痛功效，可用于治疗胃疼、胀满、痞闷等。其所含成分复杂，加之中药制剂所用药材和药材饮片因产地、采收季节、炮制方法等的不同易导致质量差异较大。现行质量标准［1-2］仅针对其成分延胡索和延胡索乙素设置了薄层色谱鉴别项，文献［3 - 4］增加了麦冬、人参皂苷Rg1、没食子酸、当归、川芎的薄层色谱鉴别项，但仅对芍药苷进行了定量研究，难以有效控制其整体质量。鉴于此，本研究中采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定摩罗丹中哈巴苷、哈巴俄苷、人参皂苷Rb1、芍药苷、延胡索乙素的含量，以为全面评价该制剂质量提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Thermo U3000 型高效液相色谱仪［配有二极管阵列检测器（DAD），美国Thermo Fisher Scientific 公司］；XSE205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KH5200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试药

摩罗丹（邯郸制药股份有限公司，批号分别为00422126，00321015，00122021的产品为大蜜丸，规格为每丸9 g，批号为S00320142的产品为小蜜丸，规格为每55粒9 g）；哈巴苷对照品（批号为111729 - 201707，含量96.8%），芍药苷对照品（批号为110736-202145，含量94.6%），延胡索乙素对照品（批号为110726-202020，含量99.3%），哈巴俄苷对照品（批号为111730-202110，含量96.8%），人参皂苷Rb1对照品（批号为110704 -201223，含量95.9%），均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB - C18柱（250 mm ×4.6 mm，5µm）；流动相：乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）［5-10］，梯度洗脱（0～10 min 时3%A，10～11 min 时3%A →15%A，11～15 min 时15%A，15～30 min 时15%A →20%A，30～40 min 时20%A →25%A，40～47 min 时25%A，47～70 min 时25%A →36%A，70～75 min 时36%A →3%A；流速：1.0 mL/min；检测波长：0～12 min时210 nm（哈巴苷），12～26 min时230 nm（芍药苷），26～55 min 时280 nm（延胡索乙素、哈巴俄苷），55～75 min 时203 nm（人参皂苷Rb1）［11］；柱温：20 ℃；进样量：10µL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取各对照品适量，精密称定，加70%甲醇，制成分别含哈巴苷0.021 4 mg/mL、芍药苷2.582 6 mg/ mL，延胡索乙素0.088 2 mg/ mL，哈巴俄苷0.126 4 mg/mL，人参皂苷Rb14.512 1 mg/mL 的混合对照品贮备液。精密量取2 mL，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，制成含哈巴苷1.712 µg/ mL、芍药苷206.6 µg/ mL、延胡索乙素7.056 µg/ mL、哈巴俄苷10.11µg/mL、人参皂苷Rb1361.0µg/mL 的混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品（剪碎）约5.0 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 mL，称定质量，超声（功率200 W、频率40 kHz）处理45 min，室温放冷，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按摩罗丹处方及工艺分别制备缺玄参、白芍、延胡索、三七的单一阴性样品，按供试品溶液制备方法制备相应阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验和专属性试验：分别取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果供试品溶液色谱图，在与混合对照品溶液色谱图相同保留时间处有相应色谱峰；5 种成分色谱峰分离度均大于1.5，理论板数均大于5 000，且阴性对照无干扰。详见图1。

1.哈巴苷 2.芍药苷 3.延胡索乙素 4.哈巴俄苷 5.人参皂苷Rb1A.混合对照品溶液 B.供试品溶液 C - F.阴性对照品溶液（分别缺玄参、白芍、延胡索、三七）图1 高效液相色谱图1.Harpagide 2.Paeoniflorin 3.Tetrahydropalmatine 4.Harpagoside 5.Ginsenoside Rb1A.Mixed reference solution B.Test solution C - F.Negative reference solution（lacking Scrophulariae Radix，Paeoniae Radix Alba，Corydalis Rhizoma and Notoginseng Radix et Rhizoma，respectively）Fig.1 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取2.2项下混合对照品贮备液0.4，1.2，2.0，2.8，3.6，4.4 mL，分别置25 mL容量瓶中，加70%甲醇定容，得系列混合对照品溶液。各取10 µL，按2.1项下色谱条件进样测定，以待测成分质量浓度（X，µg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程与线性范围。结果见表1。

表1 线性关系及检测限、定量限考察结果（n=6）Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ（n=6）

检测限与定量限考察：精密量取2.2项下混合对照品溶液适量，逐步稀释，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以信噪比（S/N）分别约为3∶1 和10∶1 时待测成分质量浓度记为检测限和定量限。结果见表1。

精密度试验：取2.2 项下混合对照品溶液适量，按2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果哈巴苷、芍药苷、延胡索乙素、哈巴俄苷、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为0.79%，0.42%，1.10%，1.30%，0.56%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品（批号为00422126）溶液适量，分别于室温下放置0，4，8，12，16，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果哈巴苷、芍药苷、延胡索乙素、哈巴俄苷、人参皂苷Rb1峰面积的RSD分别为1.90%，0.52%，1.00%，1.70%，0.88%（n= 6），表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

重复性试验：取同一批（批号为00422126）样品6份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品含量。结果哈巴苷、芍药苷、延胡索乙素、哈巴俄苷、人参皂苷Rb1的平均含量分别为0.008 8，1.10，0.036，0.051，1.74 mg/g，RSD分别为1.20%，0.88%，1.50%，1.40%，1.10%（n= 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：将已知含量的样品（批号为00422126）剪碎，取9 份，每份约2.5 g，精密称定，分别精密加入2.2 项下混合对照品贮备液0.5，1.0，1.5 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=9）Tab.2 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取4 批样品各适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算5种成分的含量。结果见表3（-为未测出）。

表3 样品含量测定结果（mg/g，n=3）Tab.3 Results of content determination of five components in samples（mg/g，n=3）

3 讨论

3.1 提取条件选择

预试验中分别比较了以50%，70%，100%甲醇和50%，70%，100%乙醇为提取溶剂时的提取效果。结果表明，与50%，100%甲醇比较，以70%甲醇提取时，更能兼顾到5 种成分提取率，且杂质干扰少。还比较了浸泡过夜、索氏提取、超声提取（功率200 W，频率40 kHz）、加热回流法等提取方法，结果显示，浸泡过夜和索氏提取2 种方法提取率均较低，超声提取法与加热回流法2 种方法提取时各成分提取量无明显差异，而超声提取法更简便。最后考察提取时间，分别超声提取30，45，60 min，发现45 min 时各成分可提取完全。因此，正式试验中对摩罗丹样品采用70%甲醇超声提取45 min。

3.2 指标成分选择

摩罗丹组方中，百合养阴润肺，麦冬养阴生津，石斛益胃生津，玄参滋阴降火，共为君药；蒲黄、三七止血，川芎、当归活血，茯苓、白术健脾，鸡内金健胃，共为臣药；地榆凉血止血，泽泻利水渗湿，茵陈清利湿热，九节菖蒲开窍化痰，共为佐药；白芍养血调经，乌药行气止痛，延胡索活血行气，共为使药。本研究中兼顾君臣佐使药，选取方中君药玄参主要活性成分哈巴苷、哈巴俄苷，臣药三七主要药效成分人参皂苷Rb1，以及使药白芍代表性成分芍药苷，延胡索主要药效成分延胡索乙素为定量研究指标成分，以全面评价摩罗丹的整体质量。

3.3 色谱条件选择

检测波长：预试验中以DAD检测器，在190～400 nm波长范围内扫描混合对照品溶液，测定各组分最大吸收波长，显示哈巴苷、人参皂苷Rb1在203 nm，芍药苷在230 nm，哈巴俄苷在278 nm、延胡索乙素在282 nm 波长处有最大吸收。哈巴苷的最大吸收波长属紫外末端吸收，影响定量准确性，故参考现行药典标准设定检测波长为210 nm。因282 nm 与278 nm 十分接近，考察后发现280 nm 波长对定量无影响，故选取280 nm 波长测定延胡索乙素和哈巴俄苷。

流动相：预试验中对甲醇- 水、乙腈- 水、甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈- 0.05%磷酸水溶液等流动相体系进行考察，结果显示，有机相为乙腈时洗脱能力强，基线更平稳，柱压较低，无机相中加入磷酸后，峰形和分离度均得到了改善。故选用乙腈- 0.05%磷酸水溶液作为梯度洗脱的流动相。

柱温：在检测波长与流动相体系确定的情况下，柱温分别设定为20，30，40 ℃，结果显示，样品中最易受到杂质峰干扰的延胡索乙素及哈巴俄苷在20 ℃时分离度均最高，故柱温选择20 ℃。

3.4 含量分析

摩罗丹属中药成方保护品种，处方中各组分剂量和制法工艺未公开。故在预试验中对玄参饮片（购自北京同仁堂安徽连锁药店有限责任公司铜陵店）进行含量测定，结果哈巴苷含量为1.19 mg/g，哈巴俄苷含量为0.367 mg/g，差异较大。参考文献［12- 15］，不同产地玄参所含哈巴苷或哈巴俄苷含量存在极显著差异，且不同加工方法也会导致两者含量有显著差异。摩罗丹与自购玄参饮片中哈巴苷、哈巴俄苷含量差异显著的原因可能在此。