潘澍青 潘小莉 潘婕文 李海波 庄丹燕

(宁波市妇女儿童医院出生缺陷综合防治重点实验室 宁波 315000)

2021 年3 月，世界卫生组织(WHO)发布的首份《世界听力报告》警告，到2050 年，全世界近25 亿人(即1/4 的人)将有某种程度的听力问题[1]。另外，2012 年《中国出生缺陷防治报告》显示，耳聋已经成为我国第二大出生缺陷疾病，且每年约有3.5 万例先天性耳聋患儿出生，其中50%～60% 是由遗传因素引起的[2]。如此庞大的耳聋人群，给家庭和社会都带来了沉重的经济压力和精神负担。开展新生儿耳聋基因筛查可尽早发现携带先天性耳聋、药物性耳聋和迟发性耳聋相关基因的人群，对预防其听力损失具有重要的临床意义。本研究通过对宁波部分地区11 914 例新生儿耳聋基因筛查结果进行分析，了解该地区新生儿常见耳聋基因突变类型和突变频率，为临床耳聋基因检测及病因诊断提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 资料

选取2019 年12 月～2022 年5 月在宁波市妇女儿童医院出生的，经宣讲后同意参加耳聋基因筛查的11 914 例新生儿作为研究对象。其中男婴6 150 例、女婴5 764 例，男女比例为1.07:1。所有参与研究的新生儿均由家长等监护人员签署知情同意书。

1.2 新生儿耳聋基因筛查

1.2.1 血斑采集 新生儿出生3 d 内采集足跟血，滴于专用滤纸片上，血斑直径不小于8 mm，自然晾干4 h 左右，置4 ℃冰箱保存。

1.2.2 DNA 提取 先用打孔枪打取1～2 片直径6 mm 的血斑至1.5 mL 离心管中；再采用Lab-Aid 824 核酸提取Micro 试剂(厦门致善生物科技股份有限公司)提取DNA；然后使用Nano DropND-2000 分光光度计(Thermo Fisher)分 析DNA 的浓度和纯度，当A260/A280 在1.6～2.0，A260/A230 ＞2.0 时认为DNA 的纯度是可靠的，可进行下一步实验。

1.2.3 耳聋基因检测 应用荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR；厦门致善生物科技股份有限公司)熔解曲线法遗传性耳聋基因检测试剂盒，对4 种常见耳聋基因的15 个位点进行检测，包括GJB2(c.35delG、c.176-191del16、c.235delC 和c.299-300delAT)、线粒体12S rRNA(m.1494C ＞T和m.1555A ＞G)，SLC26A4(c.919-2A ＞G、c.1174A＞T、c.1226G ＞A、c.1229C ＞T、c.1707+5G ＞A、c.1975G ＞C、c.2027T ＞A 和c.2168A ＞G)和GJB3(c.538C ＞T)。

1.3 随访及遗传咨询 对耳聋基因筛查结果阳性的新生儿进行随访，了解每个患儿的听力情况，如有必要采取干预措施和尽早治疗。对有需要再生育的父母进行遗传咨询，降低出生缺陷。

1.4 统计学处理 建立Excel 数据库，应用SPSS 19.0 软件进行统计学分析。耳聋基因筛查的实验结果，计数资料以百分率(%)表示，组间数据比较采用卡方检验，以P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 新生儿耳聋基因突变类型及突变频率 11 914例新生儿中，共检出586 例耳聋基因突变，突变检出率为4.92%。其中男婴检出耳聋基因突变310例，检出率为2.60%；女婴检出耳聋基因突变276 例，检出率为2.32%。男婴和女婴之间的耳聋基因筛查的检出率差异无统计学意义(χ2=0.405，P=0.525)。586 例耳聋基因突变中，GJB2基因突变306 例(2.57%)，GJB3基因突变30 例(0.25%)，SLC26A4基因突变219 例(1.84%)，线粒体12S rRNA基因突变23 例(0.19%)；有8 例新生儿携带2 种基因的突变位点(0.07%)。耳聋基因筛查结果见表1。

表1 新生儿4种耳聋基因筛查结果

2.2 新生儿耳聋基因筛查阳性随访 586 例耳聋基因突变中，有10 例新生儿听力异常，分别为9 例GJB2基因突变(3 例c.235delC 纯合突变、3例c.235delC 杂合突变、2 例c.235delC 与c.176-191del16 复合杂合突变和1 例c.176-191del16 杂合突变)和1 例SLC26A4基因c.919-2A＞G 纯合突变。以听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)阈值来评判听力损失程度。3 例GJB2基因c.235delC 纯合突变的新生儿表现为1例左耳重度/右耳中度听力损失和2 例双耳中度听力损失；3 例GJB2基因c.235delC 杂合突变的新生儿表现为1 例左耳轻度/右耳中度听力损失、1例双耳轻度听力损失和1 例双耳中度听力损失；2 例GJB2基 因c.235delC 与c.176-191del16 复 合杂合突变的新生儿表现为2 例双耳极重度听力损失；1 例GJB2基因c.176-191del16 杂合突变的新生儿表现为左耳轻度/右耳中度听力损失；1 例SLC26A4基因c.919-2A＞G 纯合突变的新生儿表现为左耳中度/右耳轻度听力损失(表2)。

表2 新生儿听力异常情况分析

3 讨论

耳聋作为一种影响日常沟通和生活质量的听觉障碍性疾病，已经成为新生儿出生缺陷的主要原因。目前，我国各地妇儿医院均有开展新生儿听力筛查，但由于常规的听力筛查存在一定的局限性，部分迟发型或药物敏感型耳聋患儿可能无法被及时检出。2000 年，Green 提出新生儿应该进行耳聋基因筛查[3]，作为新生儿听力筛查的补充，有助于明确耳聋致病原因，尽可能实现早发现、早诊断、早治疗，对优生优育、降低新生儿出生缺陷有着重要的意义。

本研究应用荧光PCR 熔解曲线法对11 914例新生儿进行耳聋基因筛查，检出基因突变586例，检出率为4.92%。其中，GJB2基因突变306 例(2.57%)，GJB3基因突变30 例(0.25%)，SLC26A4基因突变219 例(1.84%)，线粒体12S rRNA基因突变23 例(0.19%)；有8 例新生儿携带2 种基因的突变位点(0.07%)。邱小兵等[4]对江西地区新生儿进行耳聋基因筛查，得出耳聋基因检出率为4.13%，张秀秀等[5]则得出黔西南地区的新生儿耳聋基因检出率为2.82%，戴朴等[6]报告北京地区的新生儿耳聋基因检出率为4.51%。均低于本研究的4.92%，原因可能与检测方法、检测数量和各区域遗传背景差异等有关。由此可见，宁波部分地区新生儿耳聋基因突变率略高于全国大部分地区，适合开展大规模耳聋基因筛查。

GJB2基因是1997 年被克隆发现的，定位于13q11-12，主要由2 个外显子组成，编码区主要存在于第2 外显子上，是导致非综合征型耳聋(non-syndromic hearing loss，NSHL)的最常见原因[7]。本研究中GJB2基因c.235delC 突变检出率最高，包括232 例杂合突变和3 例纯合突变，占1.98%，其次为c.299-300delAT、c.176-191del16和c.35delG。研究还检出3 例复合杂合突变(GJB2基因c.35delG 与c.235delC 复合杂合突变1 例，GJB2基因c.235delC 与c.176-191del16 复合杂合突变2 例)，突变检出率为0.03%(表1)。后期随访发现9 例GJB2基因突变的新生儿听力存在异常(表2)，其中有5 例GJB2基因纯合突变和复合杂合突变，新生儿听力表现为1 例左耳重度/右耳中度听力损失、2 例双耳中度听力损失和2 例双耳极重度听力损失，从侧面证实GJB2基因纯合突变或复合杂合突变会导致双侧听力损失，且多数为重度或极重度耳聋[8]。还有1 例检出GJB2基因c.35delG 和c.235delC 复合杂合突变的新生儿，听力正常，可能原因是遗传性耳聋具有高度的遗传异质性，GJB2基因的外显率为72%～96.2%[6]，即使携带2 种致病性的突变位点，也会出现迟发性轻度听力损失，甚至表现出正常听力，所以我们应该对这类患儿加强随访，以免发生漏筛而耽误治疗。

SLC26A4基因是继GJB2基因之后导致NSHL的第二大常见基因，位于7q22-31 上，由21 个外显子组成。本研究共检测出SLC26A4基因突变219 例，检出率为1.84%，其中SLC26A4基因最常见的3 个突变位点分别是c.919-2A＞G(1.19%)、c.1707+5G＞A(0.22%)和c.2168A ＞G(0.17%)。与文献报道的我国SLC26A4基因突变最常见突变位点是c.919-2A＞G，其次是c.2168A ＞G 不符[9-10]，说明SLC26A4基因突变在不同地区之间存在差异。在219 例SLC26A4基因突变的新生儿中，只有1 例检出c.919-2A＞G 纯合突变，该新生儿在后期经听力学诊断确诊左耳中度听力损失/ 右耳轻度听力损失。虽然其他新生儿听力正常，但检出SLC26A4基因突变的患儿均应长期随访，避免因感冒、摔倒、颅内高压等一系列问题引发耳聋，一旦发现需及时干预。有研究[11]表明，检出GJB2基因及SLC26A4基因突变的耳聋患儿，如及时佩戴助听器、植入人工耳蜗有很好的疗效。

线粒体DNA 是人类细胞质中唯一的DNA 分子，编码13 个蛋白质亚基，2 个rRNA 和22 个tRNA[12]。当发现有携带线粒体12S rRNA基因者，应终身禁用氨基糖苷类抗生素，避免药物性耳聋的发生[13]。线粒体12S rRNA基因最常见的突变位点为m.1555A＞G 和m.1494C＞T[14]。本研究共检测出线粒体12S rRNA基因突变23 例，其中m.1555A＞G 的检出率为0.18%，m.1494C＞T 的检出率为0.02%(表1)，在后期随访中，23 例新生儿听力均正常。因线粒体12S rRNA基因突变属于母系遗传，耳聋基因的筛查结果也可应用于其母系家庭的其他成员。对他们使用氨基糖苷类抗生素具有同样的指导作用，因此应在生活中禁止使用这些药物，避免“一针致聋”。

GJB3基因于1998 年由我国科学家夏家辉教授首次克隆成功发现，定位于lp33-35 上，具有2 个外显子。根据文献报道，GJB3基因是导致我国NSHL 的常见原因之一，但是近年来有较多研究发现，在我国耳聋患者中GJB3基因的突变率比较低[6]。本研究中共筛查出GJB3基因c.538C＞T突变30 例，检出率为0.25%(表1)，在后期随访中，30 例新生儿听力均正常。但有文献[15]显示，GJB3基因突变造成的听力损失多为语后聋，即迟发性听力损失，应加强对这部分人群的宣教，避免因年龄增大而出现听力损失。

综上所述，宁波部分地区新生儿耳聋基因突变率略高于全国大部分地区，适合开展大规模耳聋基因筛查；GJB2基因c.235delC 和SLC26A4基因c.919-2A＞G 是该地区新生儿常见耳聋基因的突变位点，为临床耳聋基因检测及病因诊断提供参考依据。开展新生儿耳聋基因筛查可尽早发现携带先天遗传性耳聋、药物性耳聋和迟发性耳聋相关基因的人群，对耳聋的早期预防、诊断和治疗具有重要的临床意义，可降低耳聋的发病率，提高人口素质。