胡文静，刘小雪，梁 栋，焦凌霞

（河南科技学院食品学院 河南新乡 453003）

酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterristris）主要存在于酸性土壤及苹果汁、番茄汁等酸性果汁中，是一种革兰氏阳性细菌，具有嗜酸耐热特性，好氧、无致病性，由该菌污染引起的果汁营养损失、风味劣变、出现沉淀等质量问题已成为制约果蔬加工及出口贸易的瓶颈[1-3]。据报道，35%的果汁产品变质问题都是因酸土脂环酸芽孢杆菌污染引起的。该菌在不利条件下可形成抗逆性极强的芽孢，条件适宜时芽孢便会萌发生长，产生愈创木酚、2，6-二溴苯酚和2，6-二氯苯酚等代谢产物，散发出难闻气味并引起产品沉淀，是果汁加工行业比较棘手的问题[4-6]。作为果汁产业的关键质量因子，关于酸土脂环酸芽孢杆菌的控制研究已有30 多年。在已报道的灭菌方法中，物理法控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染的能源及经济消耗较大[7]。高温处理是生产中常用的控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染的方法，热处理虽具有杀菌时间短、灭菌效果好的优点，但对果汁的营养成分和感官品质破坏严重[8]。新型灭菌技术中超高压灭菌法对酸土脂环酸芽孢杆菌的杀灭效果较好，能较好地保存果汁产品的营养成分，然而对仪器的要求较高，经济耗费较大[9]。化学法对抑制酸土脂环酸芽孢杆菌也有一定的效果，生产上常用苯甲酸、亚氯酸、次氯酸钠等来抑制酸土脂环酸芽孢杆菌，然而苯甲酸含有刺激性气味，会影响果汁口感，亚氯酸在室温下不稳定，极易分解，在使用过程中对操作技术的要求较高[10-11]。随着人们健康意识的增强，具有抑菌性能的天然物质及其衍生物逐渐被开发并应用到食品工业中[12]。有研究报道天然化合物如石榴提取物、葡萄籽提取物、胡椒提取物等对酸土脂环酸芽孢杆菌有一定的抑菌效果，但多数植物提取物含有叶绿素、花色素、黄酮类色素等或者具有不良气味的挥发性气体，而且达到生产要求的抑菌效果的使用剂量较大，往往会影响产品的色泽、口感及风味等感官品质[13]。因此，果汁工业急需开创新型高效的有利于保存果汁营养成分的酸土脂环酸芽孢杆菌控制技术。

肌苷，又称次黄苷，属于人体的正常成分，无色、无味，目前常用于食品加工和制药行业[14-15]。有研究发现，肌苷可以促进细菌芽孢的复苏，对蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的芽孢复苏均有促进的效果[16-17]。然而，课题组在研究肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢萌发的影响时发现，它不仅不能促进该菌芽孢的萌发，反而能延缓其芽孢萌发并导致萌发后的营养菌体死亡。鉴于酸土脂环酸芽孢杆菌具有独特的嗜酸耐热生理特性，推测肌苷在酸性条件下对该菌可能有特异性抑菌作用。本文通过测定肌苷处理前、后的酸土脂环酸芽孢杆菌生长和生存情况，形态变化及生物膜形成能力来检测肌苷对该菌的抑制效果，研究较好抑菌效果的肌苷添加量对橙汁酸度、糖度、色度及口感的影响，为开发控制酸性果蔬制品中酸土脂环酸芽孢杆菌污染的新型绿色高效抑菌剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterristris DSM 3922T），购于德国菌种保藏中心；肌苷、戊二醛、无水乙醇均为分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司；橙子为市售鲜果。

ZQTY-70F 全温振荡培养箱，常州普天仪器制造有限公司；TGL-16B 台式高速离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；ES-315 全自动高压灭菌器，上海民仪电子有限公司；H1987 手持糖度折光仪，邢台德延科技有限公司；CR400 便携式色差仪，深圳市百诚欣电子科技有限公司；环境扫描电子显微镜，北京普瑞赛司有限公司；Varioskan LUX 多功能酶标仪，赛默飞世尔科技公司；MJBL80Y21 美的榨汁机，河南省萱格商贸有限公司。

1.2 培养基的制备

AAM 液体培养基：葡萄糖2.0 g，酵母浸粉2.0 g，氯化钙0.38 g，磷酸二氢钾1.2 g，七水硫酸镁1.0 g，一水硫酸锰0.38 g，硫酸铵0.4 g，加灭菌水定容至1 L，调pH 值至4.0，121 ℃高压灭菌15 min；

AAM 固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.5%～1.8%的琼脂。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株培养条件 将冷冻保藏的酸土脂环酸芽孢杆菌接种于AAM 液体培养基中，在45 ℃、250 r/min 条件下活化培养12 h，然后按1%接种量再转接至AAM 培养基中，45 ℃、250 r/min 振荡培养。

1.3.2 光密度法测定酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线 将活化12 h 的菌液按1%的接种量分别接种于含肌苷浓度为0，1，5，10，20，30 mmol/L 的AAM液体培养基中，45 ℃、250 r/min 振荡培养24 h，每2 h 测定一次菌液吸光值（OD600nm）。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，制作不同浓度肌苷处理下酸土脂环酸芽孢杆菌的生长曲线。

1.3.3 结晶紫染色法测定生物膜形成量 根据朱军莉等[18]采用的96 孔板定量法，取20 μL 106CFU/mL 菌悬液置于96 孔板中，每孔分别加入200 μL 含0，1，5，10，20，30 mmol/L 肌苷浓度的AAM 培养液。然后将96 孔板置于45 ℃培养箱中静置培养24 h，使细菌完全附着在孔板表面。培养结束后，每孔中加入0.01 mol/L 的无菌PBS 缓冲液清洗3 次。待96 孔板风干后，加入无水甲醇固定15 min，弃去孔中废液后风干。然后加入1%的结晶紫溶液，置于室温下染色15 min 后，用流动去离子水洗去孔板中残余的结晶紫染料后风干，再加入200 μL 33%的冰乙酸溶液进行脱色。脱色完成后，用酶标仪测定每孔的OD600nm值，分析生物被膜形成量。

1.3.4 环境扫描电子显微镜检测酸土脂环酸芽孢杆菌形态 根据潘旭迟等[19]描述的方法，将活化至对数期的菌液以1%接种量分别加入肌苷浓度为0 mmol/L 和5 mmol/L 的培养液中，45 ℃、250 r/min 振荡培养，分别取培养6，12，18，24 h 的菌液，离心收集菌体，用预冷的无菌水反复清洗3～5 次，加入体积分数为2.5%的戊二醛溶液，置于4 ℃环境下固定2 h 以上。将固定好的样品用预冷的无菌水反复清洗后，利用35%，50%，70%，80%，90%和100%体积分数的乙醇进行梯度脱水后再用无水乙醇重悬。取适量菌悬液滴加于玻片上，自然风干后喷金，利用环境扫描电子显微镜观察菌体形态。

1.3.5 平板计数法测定酸土脂环酸芽孢杆菌生存情况 将菌体浓度为107CFU/mL 的菌液分别接种至含0，1，5，10，20，30 mmol/L 浓度肌苷的AAM培养液中，调整该菌液的初始菌浓度分别为105CFU/mL 和106CFU/mL，45 ℃，250 r/min 条件下振荡培养72 h。每6 h 取100 μL 菌液梯度稀释后涂布于AAM 固体平板上，45 ℃，倒置培养24 h 后进行菌落计数，检测酸土脂环酸芽孢杆菌的存活情况。

1.3.6 鲜榨橙汁制备 选取成熟、饱满的新鲜橙子，清洗干净后加入适量纯水，使用榨汁机制汁，用干净的纱布过滤3～4 次，90 ℃，5 min 杀菌备用。

3.播种田间湿度 田间土壤持水量为70%—80%播种最佳，即田间土壤能手捏成团，但不能挤压出水。如果田间土壤含水量大，则播种后不急于盖膜，待田间土壤水分适当蒸发后再盖膜。如果田间土壤干燥，则播种后每窝适当灌水0.3—0.5公斤左右后再盖膜。

1.3.7 果汁理化指标测定 在鲜榨橙汁中分别加入终浓度为0，1，5，10，20，30 mmol/L 的肌苷，按照邓红等[20]所述检测方法，利用pH 仪、手持式糖度折光仪、便携式色差仪测定橙汁的酸度、糖度（可溶性固形物含量，TSS）、颜色参数等理化指标。样品总色差计算公式为：

式中L*代表明暗度，a*代表红绿色值，b*代表黄蓝色值。

1.3.8 果汁感官评定 参考崔燕等[21]对果汁感官鉴定的方法，制订表1 中鲜榨橙汁的评分标准，选择10 名食品专业的学生分别从气味、色泽、口感、状态4 个方面对橙汁进行感官评价，总分为100分。

表1 鲜榨橙汁的感官评分标准Table 1 Sensory scoring standard for fresh orange juice

1.4 数据处理与分析

所有试验重复3 次，采用Origin9.0 进行绘图，运用SPSS 23 软件Duncan 进行方差分析（ANOVA）（P<0.05），试验结果以表示。

2 结果与分析

2.1 肌苷对低浓度的酸土脂环酸芽孢杆菌的抑制效果

将过夜活化的酸土脂环酸芽孢杆菌以1%接种量接种于含不同浓度肌苷的AAM 液体培养基中，经平板菌落计数法测定，菌液的初始菌体浓度为104CFU/mL。如图1 所示，在不含肌苷的对照组AAM 培养液中，酸土脂环酸芽孢杆菌生长良好，培养2 h 后开始进入对数期，培养至12 h 时菌体密度最高，OD600nm值达到1.36，12 h 后菌体密度略有下降，菌株生长进入稳定期，培养24 h 时其OD600nm值为1.057，这和课题组前期研究中测定的同一培养条件下的生长曲线保持一致[22]。在含1 mmol/L 肌苷的AAM 培养液中，菌体生长稍慢，培养至12 h 时，菌体密度最高，OD600nm值仅为0.57，是对照组的0.42 倍。培养24 h 后，菌体的OD600nm值为0.342，是对照组的0.32 倍。培养液中肌苷浓度升至5 mmol/L 时，酸土脂环酸芽孢杆菌的生长明显被抑制，培养12 h 时的菌液OD600nm值仅为0.40，是对照组的0.29 倍。培养至24 h，菌液OD600nm值降至0.17，是对照组的0.16 倍。随着肌苷浓度的继续增加，对该菌的抑制效果也有所增强。肌苷浓度分别为10，20，30 mmol/L 的AAM 培养液中，菌液最高OD600nm值分别为0.337，0.328 和0.315。表明肌苷浓度高于5 mmol/L 时，抑菌效果并没有明显提升。因此，对初始污染菌含量不高于104CFU/mL 时，5 mmol/L 的肌苷浓度即能达到较好的抑制酸土脂环酸芽孢杆菌生长繁殖的效果。

图1 酸土脂环酸芽孢杆菌在添加不同浓度肌苷的AAM 培养液中的生长曲线Fig.1 Growth curve of A.acidoterristris in AAM medium with different concentrations of inosine

2.2 肌苷对高初始菌体浓度的酸土脂环酸芽孢杆菌的抑制效果

实际生产上常用的抑菌剂在产品初始污染菌含量高时便会失去防腐效果。为检测肌苷对高初始菌体浓度的抑制效果，本文检测了初始菌体浓度分别为105CFU/mL 和106CFU/mL 的酸土脂环酸芽孢杆菌在不同浓度肌苷作用下的存活情况。如图2a 所示，初始菌体浓度为105CFU/mL 的酸土脂环酸芽孢杆菌营养菌体在不含肌苷的培养液中，随培养时间延长，菌落数也稳定增长，12 h 后达到最高，为7.41 lg（CFU/mL）。在1 mmol/L 肌苷培养液中，培养初期，菌落数呈上升趋势，作用12 h 后，菌体数量逐渐下降，最高菌落数达6.9 lg（CFU/mL）。随着肌苷浓度增大，菌体生长受到了明显的抑制，在5，10，20，30 mmol/L 的肌苷培养液中，最高菌落数分别为4.53，4.30，4.20，4.17 lg（CFU/mL），与初始菌体量相比，菌体数量下降了1个数量级。

图2 肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌菌体的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of inosine on A.acidoterristris

当初始菌体密度为106CFU/mL 时，在不含肌苷的培养液中，菌落数最高可达7.49 lg（CFU/mL）。在含在1，5，10，20，30 mmol/L 的肌苷培养液中，菌落数最高分别为6.94，6.10，6.03，5.82，5.66 lg（CFU/mL），与初始菌体量相比，菌体数量没有增加。结果表明，5 mmol/L 的肌苷浓度在初始污染菌含量高达105CFU/mL 和106CFU/mL 时，仍具有较好的抑菌效果。

2.3 肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌菌体形态的影响

扫描电子显微镜检测结果如图3 所示，不添加肌苷的对照组的酸土脂环酸芽孢杆菌在培养至6 h 时，菌体形态结构完整，表面光滑饱满，菌体呈长杆状，处于分裂增殖阶段；12 h 时进入稳定期，菌体呈正常的杆状；18 h 时，菌体顶端膨大，大部分菌体变短变圆，开始形成芽孢；24 h 时，绝大部分营养菌体已形成芽孢。5 mmol/L 肌苷处理的试验组中，肌苷作用6 h 时，与同时段对照组的菌体形态相比，菌体形态较完整，饱满度稍差，但也存在分裂增殖现象；作用12 h 时，大部分菌体细胞壁受损，表面凹陷；作用时间增至18 h 和24 h 时，细胞壁受损加重，菌体干瘪皱缩，表面粗糙，出现严重的破裂和孔洞，而且菌体颜色逐渐加深，可能是由于细胞裂解、细胞内容物泄露导致菌体的导电性降低造成的。结果表明，肌苷能够破坏和损伤酸土脂环酸芽孢杆菌的细胞壁和细胞膜。

2.4 肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌生物膜形成的影响

如图4 所示，肌苷处理后，酸土脂环酸芽孢杆菌的生物被膜形成量与对照组相比明显降低（P<0.05）。随着肌苷浓度的增加，生物被膜的含量逐渐减小。经1，5，10，20，30 mmol/L 肌苷作用的酸土脂环酸芽孢杆菌生物被膜形成量在OD600nm的吸光值 由0.57 分别下降至0.51，0.30，0.29，0.26和0.25，表明肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌生物被膜的形成有显著的抑制作用（P<0.05）。

图4 不同浓度肌苷处理酸土脂环酸芽孢杆菌后生物膜的形成量Fig.4 Biofilm formation treated with different concentrations of inosine

2.5 肌苷对橙汁理化特性及感官品质的影响

果汁的酸度、糖度及色泽是影响果汁品质的主要指标。肌苷无色无味，推测其对果汁的品质应该不产生影响。经验证发现（表2），相同处理时间下肌苷添加量高低对橙汁的酸度、糖度（TSS 含量）及色泽均无显著影响（P<0.05）；但是随着处理时间延长，不添加肌苷的对照组和添加不同浓度肌苷的试验组中，橙汁的糖度（TSS 含量）和L*值（明暗度）都有所增加。这可能是由于取样测定过程中有空气混入导致果汁营养成分发生氧化所致。在24 h 的肌苷处理过程中，添加不同肌苷浓度的橙汁的总色差（ΔE）最大值为1.86，一般ΔE>3 时，才能肉眼观察出颜色的变化[23]。因此，肌苷对橙汁色泽的影响是肉眼觉察不到的。在相同处理时间下，肌苷添加量低于5 mmol/L 的试验组果汁的酸度、糖度（TSS 含量）及色泽均与对照组无显著差异（P<0.05）。

表2 肌苷对橙汁理化特性的影响Table 2 Effects of inosine on physicochemical properties of orange juice

感官鉴定可更直观的分析果汁的品质。由表3 可知，添加不同浓度肌苷的橙汁，在相同放置时间下，与不添加肌苷的对照组相比，果汁原有的香味、口感、色泽、状态等均无明显变化（P<0.05）。随放置时间延长，果汁的口感和香味略有降低，可能由于取样时的空气混入导致橙汁中的醛类及酚类物质发生氧化反应，从而影响果汁的香气和口感[24]。

表3 添加不同肌苷浓度的橙汁的感官评价结果Table 3 Sensory evaluation of orange juice with different inosin concentration

3 讨论与结论

酸土脂环酸芽孢杆菌广泛存在于自然界和土壤中，其菌体和芽孢可附着在水果表面，在加工过程中不可避免地会导致果汁生产设备和产品被污染。尤其是浓缩果汁生产中，一般会利用回收果汁浓缩时蒸发的水分清洗设备，由于回收的冷凝水温度较高且呈微酸性，给酸土脂环酸芽孢杆菌生长繁殖提供了良好的环境。该菌在设备表面能形成致密的生物被膜[25]，形成生物被膜的细菌内部有致密的三维空间结构，使细菌可以大量繁殖、扩散，对环境的耐受性也增强，导致其难以从加工设备的表面被清除[26]。因此，酸土脂环酸芽孢杆菌往往通过污染生产设备、生产材料（加工水果）及半成品（浓缩果汁）等导致水果加工产品污染，对酸性果蔬产品的加工和保藏造成了严重危害，再加上该菌嗜酸耐热的特性及其芽孢的高抗逆性，也对酸性果蔬制品的灭菌工艺提出了严峻的挑战。鉴于果蔬汁中热敏性营养成分丰富，果汁加工中尤为重视杀菌工艺对果汁品质的影响，如何采用温和的方式控制该菌污染一直是食品杀菌领域亟待解决的问题。

肌苷是芽孢杆菌属细菌的细胞代谢产物，可用做食品、药品和药物中间体等，具有改善肾功能，加速肝细胞的修复等多种医疗和保健功能[27]。目前，与肌苷有关的细菌方面的研究一方面是肌苷生产细菌的选育，另一方面是对细菌芽孢萌发的促进作用[28]，尚无其抑制细菌生长繁殖的研究和报道。课题组前期研究发现，肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢萌发的作用与现有报道截然相反，不仅延缓该菌芽孢萌发且导致营养菌体死亡。由于酸土脂环酸芽孢杆菌具有嗜酸耐热的独特生理特性，推测原因可能与该菌在酸性条件下具有特殊的代谢机制有关。大部分抑菌物质主要从破坏胞内蛋白和遗传物质、损伤菌体细胞壁及抑制呼吸这三方面来发挥作用[29]。本研究发现，5 mmol/L浓度的肌苷就对酸土脂环酸芽孢杆菌的细胞壁和细胞膜具有明显的损伤作用，并导致菌体死亡。肌苷作为细胞内ATP、辅酶A、核糖核酸及脱氧核糖核酸的组成部分，能直接透过细胞膜进入细胞，参与细胞的核酸代谢、物质代谢和能量代谢，并参与蛋白质的合成[30-31]，因此，推测肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌细胞壁和细胞膜的破坏作用可能与肌苷进入菌体后对该菌的正常代谢功能造成了影响，进而导致菌体细胞壁和细胞膜合成受到影响而死亡，其分子机制有待深入研究。有研究报道，在橙汁和非碳酸饮料中，当该菌的菌体浓度达到105～106CFU/mL 时，产生的愈创木酚量就能达到嗅觉的感官阈值[32]。本研究发现，当初始污染菌含量高达105CFU/mL 和106CFU/mL 时，5 mmol/L 的肌苷添加量仍能将105CFU/mL 的初始菌体的数量降低1 个数量级，控制营养菌体的数量使之不能产生达到嗅觉阈值的愈创木酚量，抑制106CFU/mL的初始菌体数量不再增加，且对果汁的理化特性和感官品质均无显著影响。因此，鉴于肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌具有抑制芽孢萌发和低剂量高效抑杀营养菌体的双重效果，不失为理想的控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染的高效绿色特异性抑菌剂。

在检测肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌生物被膜形成能力的影响时，发现较低浓度的肌苷便可对酸土脂环酸芽孢杆菌的生物被膜量发挥抑制作用。推测肌苷可能一方面抑制了酸土脂环酸芽孢杆菌的生长而影响其生物被膜的形成量[33]，另一方面可能是由于肌苷影响了酸土脂环酸芽孢杆菌细胞代谢，导致其胞外蛋白或多糖分泌减少，降低了菌体的黏附性，干扰了生物被膜的形成[34]。细菌的生物被膜形成力与多种因素有关，如营养条件、环境等，因此肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌生物膜形成的影响机制需要进一步探讨。菌体生物被膜含量的减少可以使菌体的活力以及抗性减弱[35]，这为肌苷协同其它抑菌剂或杀菌技术发挥更好的控制该菌污染的作用提供了试验和理论依据，肌苷有望成为酸性果汁生产中抑制酸土脂环酸芽孢杆菌污染的新型高效防腐杀菌剂。研究结果为开发能最大程度保存果汁营养成分和感官品质的新型酸土脂环酸芽孢杆菌的控制技术提供了试验和理论依据。