张 悦，张嘉嘉，李华威，罗 颖，黄 琳，樊雄飞，张 祎，孙 鹏，李芳东

（1.中国林业科学研究院经济林研究所，河南 郑州 450003；2.经济林种质创新与利用国家林业和草原局重点实验室，河南 郑州 450003）

柿Diospyroskaki属于柿科柿属，是柿属植物中果树栽培的代表种。中国是世界上柿树栽培历史最悠久的国家[1-2]，柿树栽培品种约有1 000多个[3-4]。柿果实营养丰富，既可以鲜食，也可以加工成柿饼、柿脯、柿醋和柿酒等。柿果实可溶性固形物和单宁含量高，在食品、保健和医药等领域具有很大的开发价值和应用潜力，因此柿果相关研究越来越受到重视[2,5]。

果实形状是评价果实外观品质的重要指标[6-8]。与桃、苹果等其他果树相比，柿果实形状多样性最丰富[6-16]。综合柿果实纵切面与横切面形状，柿果实形状分为圆、椭圆、卵圆及圆锥等17种[9]，可充分满足消费者的个性化需求。柿果实形状对柿饼加工影响很大，不同柿果实形状所用的削皮机械不同，晾晒方式也不同。柿果实形状对果品储运也有显著影响，果顶凹陷的品种比果顶凸尖的品种更耐储运。

理想的柿果实形状应兼具以下优点：既适合机械化采收、便于贮运，又具有良好的外观品质，受到消费者青睐[15-16]。已有的育种工作重点关注柿果的自然脱涩能力、果实风味、口感以及良种与砧木的亲和性和生长适应性等性状[17-20]，而对柿果形等外观品质缺乏关注。这一现状致使目前柿良种的果形变异丰富，缺乏优化导向，还未能培育出一个外观品质综合表现更优的品种。要开展柿果实形状改良的必要前提是：鉴定果形形成的形态学关键时期并揭示果形形成的调控机理。Maeda等[10]对柿果实形状进行了初步评价，但并未对果实整体发育过程进行系统评价，目前柿果实形状形成的形态学关键时期依然不明。柿果实形状形成调控机理研究取得了一定进展，但仍需深化[6,10]。例如，Maeda等[6]发现KNOX家族基因和SEEDSTICK基因与一些细胞激素相关基因协同调控果实形态多样性；控制番茄果实形状的OVATE家族基因，在柿果实形状多样性研究中同样具有调控作用。以上研究虽然挖掘出了一些柿果实形状形成的关键候选调控基因，但仍存在以下改进空间：1）缺乏对大量柿种质果形的系统评价，因此所选样品的典型性和代表性不强；2）缺乏对果实完整生长期内果形的系统评价，因此取样关键时间点的选择缺乏依据；3）对挖掘出的基因未做功能验证，也没有通过外施植物生长调节剂等生理调控方式进行验证。

近年来其他植物的果形形成调控研究进展主要包括以下方面：栽培番茄果实形状变异的调控基因主要有LC[21]、FAS[22]、OVATE[23]、SUN[24]和FS8.1[25-26]等。LC和FAS基因通过增加番茄果实的心室数量使果实变扁，而OVATE、SUN和FS8.1基因主要调控番茄果实的伸长生长[27-30]。其中，OVATE编码与果实伸长相关的一个负调控因子，该基因突变会导致圆形品种的番茄果实发育成梨形[23]。Cao等[31-32]筛选出调控桃果实形状的基因ppa003772m并命名为PpCAD1，该基因位于scaffold d_6(25 060 196 bp)，PpCAD1基因的第5个内含子上，PpCAD1检测到的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）的A/T变异与桃果实形状变异高度相关。

柿果实形状形成时期的确定对于果形形成机理研究至关重要。本研究前期对260份具有代表性的柿种质资源的果实进行果实形状多样性评价，发现扁椭球形果实（扁果）种质占59.6%，长椭球形果实（长果）种质占18.5%[16]。本研究基于以上研究结果，选出8个典型的长果柿品种和9个典型的扁果柿品种，从5月中旬花冠完全脱落到9月底果实达到商熟期，对果实形状形成的表型变化深入观察分析，以期揭示柿果实形状形成的形态学关键时期，为后续通过生理和分子生物学手段研究果形形成调控机理的关键采样期确定提供依据，同时为人工调控柿果实形状的关键处理期选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料及其处理

本研究在前期对260份柿种质资源果实形态多样性评价的基础上[16]，选取17份柿D.kaki栽培品种，包括8个典型的长果柿品种和9个典型的扁果柿品种（表1），分阶段进行果形评价。所有供试样品均保存于中国林业科学研究院经济林研究所原阳试验基地柿资源圃（34°55′18′′～34°56′27′′N，113°46′14′′～113°47′35′′E），该资源圃是“北方主要名优经济林树种国家林木种质资源库”的重要组成部分，由中国林业科学研究院经济林研究所柿属植物团队管理。所有样品的立地条件和管理措施一致。

表1 试验材料类型、来源及采集地Table 1 Material type,origins and collecting zones

1.2 测定项目及测定方法

1.2.1 果实形态测定

2021—2022年连续对17份柿栽培品种（表1）的果实大小和形态相关的数量性状进行测定。每个品种选取5株树势中等、树体健康的植株，从树体中部各方向结果枝上随机采收5～10个果实用于测定。从5月16日花冠完全脱落到9月27日果实达到商熟期（图1），分别在5月16日、5月28日、6月14日、6月22日、7月3日、7月14日、7月19日、7月27日、7月31日、8月14日、8月27日、9月10日、9月27日共13个时间点取样（图2为其中10个阶段的长、扁果对比），对柿果的纵径、横径、单果鲜质量、果形指数进行测定，确定柿果实形状形成的关键时期。柿果实已充分完成从绿色向橙黄或橙红的转色，但果实尚未变软，涩柿需经CO2脱涩处理才能具有鲜食的商品性[33]。柿果纵径、横径和单果鲜质量等性状参照《柿种质资源描述规范和数据标准》[9]进行测定，并根据测定数据计算果形指数（果实纵径/果实横径）。

图1 8个典型长果品种商熟期果实示意（编号对应的品种名称见表1）Fig.1 Fruit diagram of eight typical long fruit cultivars at ripening stage (the cultivar names represented by the numbers were shown in table 1)

图2 9个典型扁果品种商熟期果实示意图（编号对应的品种名称见表1）Fig.2 Fruit diagram of nine typical flat fruit cultivars at ripening stage (the cultivar names represented by the numbers were shown in table 1)

图3 长果的‘黄边小鸡心柿’（72号）和扁果的‘临潼方柿’（132号）果实在不同发育阶段的果形比较Fig.3 Comparison of fruit shape between ‘Huangbian Xiaojixin’(No.72) for long fruit and ‘Lintong Fangshi’ (No.132)for flat fruit at different developmental stages

1.2.2 果实形态多样性分析

利用SPSS 23.0软件的独立样本t检验比较同一品种的相同指标在相同发育阶段上不同年份间的差异，利用SPSS 23.0软件的单因素方差分析进行各品种的各指标在不同发育阶段上的差异比较，使用WPS 2019软件绘制观察期内果实各项数量性状均值变化的二维散点图。

各阶段长扁果果形指数比值：分别计算各个阶段长果所有品种和扁果所有品种果形指数平均值，然后各个阶段长果果形指数与扁果果形指数的比值，并用WPS 2019软件绘制变化趋势图。

2 结果与分析

2.1 不同年份柿果实形态发育差异性分析

选取长果代表性品种38、72和107，扁果代表性品种31、105和132，生长期内每月选取一个时间点分别对其表型数量性状进行年份间差异性比较。结果表明，在选取的5个时间点上，每个品种纵径、横径、单果鲜质量及果形指数在年份间无显著差异（表2）。因此，将2年数据作为生物学重复用于后续分析。

表2 表型性状差异性比较†Table 2 Comparison of differences of phenotypic characters

2.2 不同发育阶段果实表型差异比较

为了全面、综合地对柿果实表型数据进行归纳，利用长果和扁果所有品种在各发育阶段的表型数据绘制复式条形图。从图4～5可以看出，所有品种在不同阶段的变化趋势相似。由于各品种在各阶段间的表型值差异极显著（表3～4），且特定品种在特定阶段测定的表型值的标准误差值相对于均值很小，因此，为了便于观察数据的变化趋势，后续将利用均值绘制变化趋势图。（图4～5）。

图4 长果各品种在不同发育阶段上的纵径、横径、单果鲜质量和果形指数比较分析Fig.4 Comparative analysis of vertical diameter,transverse diameter,single fruit fresh mass and fruit shape index of long fruit cultivars at different developmental stages

图5 扁果各品种在不同发育阶段上的纵径、横径、单果鲜质量和果形指数比较分析Fig.5 Comparative analysis of vertical diameter,transverse diameter,single fruit fresh mass and fruit shape index of flat fruit cultivars at different developmental stages

表3 长果各品种的表型指标在各阶段间差异性比较†Table 3 Comparison of differences in morphological characters of each cultivars with long fruits among developmental stages

表4 扁果各品种的表型指标在各阶段间的差异性比较Table 4 Comparison of differences in morphological characters of each cultivars with flat fruits among developmental stages

2.3 不同发育阶段果实表型变化趋势分析

2.3.1 长果和扁果表型数量性状生长变化趋势

整个采样时期从5月16日—9月27日，长果和扁果各品种的纵径、横径、单果鲜质量均呈快—慢—快的生长模式。从5月16日—7月14日，纵径、横径、单果鲜质量等性状迅速增加；从7月14日—8月14日柿果生长速度减缓，整体小幅增长；从8月14日—9月27日，纵径、横径、单果鲜质量等性状快速增加，单果鲜质量增加尤为明显。

长果和扁果品种的果形指数变化趋势各有不同。从5月16日—7月14日长果品种的果形指数快速增加，果实呈长球形发展，增加到一定数值，果实基本定形，而后果形指数小幅动态变化（图6）；扁果品种的果形指数最低值基本都出现在5月16日—7月3日这个时期，扁果果形呈扁平状发展的动态变化，而后果实基本定形，果形指数小幅动态变化（图7）。

图6 长果各品种在不同发育阶段上的纵径、横径、单果鲜质量和果形指数变化趋势Fig.6 Trends of vertical diameter,transverse diameter,fresh mass per fruit and fruit shape index of long fruit cultivars at different developmental stages

图7 扁果各品种在不同发育阶段上的纵径、横径、单果鲜质量和果形指数变化趋势Fig.7 Trends of vertical diameter,transverse diameter,fresh mass per fruit and fruit shape index of flat fruit cultivars at different developmental stages

2.3.2 所有长果果形指数均值与所有扁果果形指数均值在不同发育阶段的比率

由图8可以看出，从5月16日—7月3日，所有长果品种的果形指数均值与所有扁果品种的果形指数均值对比最明显，数值呈直线上升趋势，7月3日后各个阶段长果果形指数均值与扁果果形指数均值比率变化幅度不大，基本趋于稳定。

图8 长果与扁果品种果形指数比值变化趋势Fig.8 Variation trends of fruit shape index ratio between long fruit and flat fruit

3 结论与讨论

本研究在前期对260份柿种质资源果实形态进行多样性评价的基础上，选取17份柿D.kaki栽培品种，包括8个典型的长果柿品种和9个典型的扁果柿品种（表1）。本研究所有样品均在2021年和2022年的相同时间点进行观察测定，果实纵径、横径和单果鲜质量在不同年份间无显著差异，说明试验基地管理水平规范，不同年份的气候、营养等因素对果实表型影响不明显。此外，果形指数主要受基因型控制，环境因素影响极微[34]，因此不同年份间同一品种的果形指数无差异符合理论预期。

本研究取样时间包括从花冠完全脱落到果实达到商熟期的完整发育过程（5月16日—9月27日）。根据果实体积和单果鲜质量的变化速率可将整个发育过程可分为三个主要阶段：第一阶段（7月14日前），所有品种的纵径、横径、单果鲜质量快速增加；第二阶段（7月14日—8月14日），果实进入缓慢生长阶段；第三阶段（8月14日—9月27日）果实生长进入快速膨大期，该阶段单果鲜质量增加尤为明显。因此，在整个取样期，果实生长呈现快—慢—快的增长模式。研究结果与王立英[34]和韩振诚等[35]关于柿果实生长发育趋势的研究基本一致，但是在柿果发育阶段划分上略有不同，这可能是由于地域和品种差异所致。

本研究系统分析了柿果完整生长发育期的表型指标，发现从5月16日—7月3日扁果横径生长速率高于纵径，果实趋于扁平；而长果与之相反，纵径生长速率高于横径，果实向长椭球形发展。在这个时间段，长果和扁果果形指数比例逐渐上升，表明二者果形差异逐渐增加。而7月3日二者比值达到最高点后基本趋于稳定，这表明长果和扁果的果形差异在7月3日以后不会再出现较大变化。因此判定从5月16日—7月3日是长果和扁果果实形状形成的关键时期，由此也进一步说明柿果实形状形成主要发生在第一个快速膨大期（5月16日—7月14日），而非第二个快速膨大期（8月14日—9月27日）。

已有报道认为柿子纵向果实形状的多样性可能由细胞增殖方向决定，而不是由细胞形状或伸长模式决定[10]，且KNAT1、STK基因和细胞分裂素在柿果实形状生长发育中可能发挥了重要作用[6]。果实形状形成的分子和生理调控关键期均应在形态学关键期或更早的时期。因此，本研究所确定的柿果实形状形成的形态学关键时期为进一步开展果形形成机理研究的关键采样期选择提供了依据，也为人工调控果实形状的关键处理期选择提供了参考。

本研究对柿果实形状的表型性状进行了观测与分析，最终确定了柿果实形态学关键时期。本研究未进行柿果实形状的机理阐述，研究内容具有一定的局限性。下面将进一步开展关键时期的果实内源激素测定，通过比较长果与扁果内源激素的含量变化，分析激素含量对柿果实形成的关系。果实形状主要由遗传上多基因控制，补充基因挖掘相关试验，从而筛选出调控柿果实形状的基因。目前的研究以广西桂林地区的油柿自然群体中的62份果形多样的油柿单株为材料，利用全基因组关联分析（GWAS）技术，挖掘出油柿的果形形成关键候选调控基因LCAT3（未发表的结果），该研究可为柿果实性状形成与调控提供参考。