李艳霞，李益萍，王肖龙

（上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203）

动脉粥样硬化是心脑血管疾病共同的病理学基础，我国心脑血管疾病患病率及死亡率仍处于上升阶段，心血管病死亡率居首位，高于肿瘤及其他疾病，占居民疾病死亡构成的40%以上［1］。尽管人们一直在努力改善动脉粥样硬化的临床治疗，但对其治疗的巨大需求仍未得到满足。无论遵循何种治疗方案，20%的患者在首次临床表现出现后的三年内都会出现复发性心肌梗死［2］。研究表明，中医药具有一定的抗动脉粥样硬化作用，并因其作用靶点多、不良反应少等优点已成为研究热点［3-4］。

盾叶冠心宁片为薯蓣根茎提取制成的膏片，具有活血化瘀、行气止痛、养血安神的功效。临床研究表明盾叶冠心宁片治疗动脉粥样硬化效果显著，可改善临床心绞痛、急性缺血性脑卒中症状，还具有调节血脂异常及降低同型半胱氨酸水平的作用［5］。近期发现，多种非编码RNA，如微小RNA （microRNA，miRNA）、长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA） 在动脉粥样硬化病理生理过程中起到重要的调节作用，可影响细胞的活化、增殖、脂质代谢和炎性因子分泌等。随着高通量测序技术的发展，其已经成为疾病发生发展机制研究常用技术手段之一。利用其信息量大、指标客观而又层次深、同时具有网络关联性的特点，可以从多角度深入挖掘盾叶冠心宁片抗动脉粥样硬化的本质。本研究观察盾叶冠心宁片对抗动脉粥样硬化的作用，同时利用高通量全基因转录组测序数据构建lncRNA-miRNA-mRNA 共表达网络，并筛选其中的关键通路。

1 材料与方法

1.1 盾叶冠心宁片抗ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化的作用

1.1.1 动物 40 只8 周龄SPF 级ApoE-/-雄性小鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （京） 2016-0011］，饲养于上海中医药大学实验动物中心，环境干燥、通风，温度20 ～26 ℃，相对湿度40% ～70%，自由获取水和食物。所有动物实验经上海中医药大学实验动物福利与伦理委员会批准 （伦理号PZSHUTCM18113010），并严格遵守动物护理和使用指南。

1.1.2 高脂饲料配方 高脂饲料由78.8%繁殖鼠料、10%蛋黄粉、10%猪油、1%胆固醇、0.2%胆盐组成，购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司［生产许可证号苏饲证（2014） 01008］。

1.1.3 试剂与药物 苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE） 染色剂购自南京建成生物工程研究所； 油红O 购自美国Sigma 公司； 马松（Masson） 染色试剂盒购自南京森贝伽生物科技有限公司； 异丙醇购自国药集团化学试剂有限公司。瑞舒伐他汀钙片［可定，阿斯利康药业（中国） 有限公司，规格10 mg/片，国药准字H20160547］； 盾叶冠心宁片（江苏黄河药业股份有限公司，国药准字Z32020309，0.16 g/片）。

1.1.4 分组、造模及给药 将40 只ApoE-/-雄性小鼠按随机数字表法随机分为空白组、模型组、可定组、盾叶组。空白组予以基础饲料，其余各组予以高脂饲料，造模的同时可定组、盾叶组按人-动物药物剂量换算表分别灌胃给予相应可定片0.76 mg/kg、盾叶冠心宁片146 mg/kg，空白组、模型组分别灌胃给予等量蒸馏水。

1.1.5 标本采集及检测 连续喂养12 周后取材，各组小鼠禁食不禁水12 h。眼底静脉丛取血，静置2 h 以上，3 000 r/min 离心15 min，分离血清，于-80 ℃保存备用。小鼠脱颈椎处死后固定，剪开腹腔，移除腹腔内脏器，暴露腹主动脉，再剪开胸腔，暴露整个腹腔与胸腔，沿着腹主动脉向上分离直至心脏，向下分离直至髂总动脉分叉处，保留主动脉及心脏。每组取10 只小鼠心脏用OCT 包埋，液氮速冻后于-80 ℃冰箱保存。将主动脉经石蜡包埋切片后按试剂盒说明书分别进行HE 染色、油红O 染色、Masson 染色，于光学显微镜下观察并拍照记录。通过Image-Pro Plus 6.0 软件分析HE 染色病变面积与整个管腔面积的比值； 油红O 染色着色区的病变面积占比； Masson染色胶原纤维面积占比。

1.2 生物信息分析 对空白组、模型组、盾叶组小鼠主动脉组织样本进行高通量测序，数据包含各个样本的lncRNA、mRNA、miRNA 测序结果。数据经过Illumina CASAVA Version 2.20 软件［6］、Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcript Version 0.1.6 软件［7］、cufflinks Version 2.2.1 软件［8］处理后，用Cuffcompare 和已知的基因模型进行比较，得到每个样本中编码基因的表达。

1.2.1 差异表达RNAs 的筛选 采用R3.4.1 中的limma（Version 3.32.5）［9］筛选每个组间差异表达RNAs，设定为FDR 值＜0.05 且|log2FC|＞1，对筛选出的组间差异表达RNAs 进行基于DAVID6.8 在线分析工具的GO 生物学过程和KEGG 通路的富集分析，筛选的标准为P＜0.05。

1.2.2 构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 调控网络 首先用miRanda 本地化工具［10］对lncRNA-miRNA 的结合关系进行预测，miRanda 比对参数设置为Gap Open Penalty ＝-8，Gap Extend＝-2，Score Threshold ＝80%，Energy Threshold ＝-20，同时计算目标lncRNA-miRNA 表达相关性系数，并只保留呈负相关的作用对，以此构建lncRNA-miRNA 网络，然后再利用starBase Version 2.0 数据库［11］对目标miRNAs所调控的靶基因进行搜索同时计算目标miRNA-mRNA 表达相关性系数，并只保留负相关的作用对，构建miRNAmRNA 调控关系连接，最后采用R3.4.1 语言中的cor.test函数计算lncRNA-mRNA 之间的皮尔森相关系数（Pearson correlation coefficient，PCC），保留高于0.9 的作用对，构建lncRNA-mRNA 网络。对上述lncRNA-miRNA、miRNAmRNA、lncRNA-mRNA 连接关系进行综合整理，最终构建lncRNA-miRNA-mRNA 调控网络，并对其进行GO 生物学过程和KEGG 通路的富集分析。

1.2.3 WGCNA 及STEM 分析重叠基因 首先运用WGCNA分析得到与疾病状态显著相关模块所包含的RNAs 其次利用STEM 分析，得到显著的表达模式变化聚类包含的RNAs，最后将上述2 种分析方法得到的重叠RNAs 进行GO生物学过程和KEGG 通路富集分析。

权重基因共表达网络分析方法 （weighed gene coexpression network analysis，WGCNA） 是一种构建基因共表达网络的典型系统生物学算法。为了符合无尺度网络分布，首先需要确定加权系数power，即R2≥0.8 时的加权系数。利用R3.4.1 中的WGCNA 包Version 1.61［12］对目标RNAs并集集合进行分析，得到与疾病状态显著相关的模块及其中包含的RNAs。

利用STEM［13］软件对空白组、模型组、盾叶组表达模式显著相似性聚类。以相似性阈值0.8，显著性阈值P＜0.05，筛选得到集合中包含的RNAs。最后对2 种方法筛选出来的重叠基因进行GO 生物学过程和KEGG 通路的富集分析。

1.3 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，计量资料符合正态分布的以（±s） 表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 盾叶冠心宁片对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠主动脉窦病理学的影响 HE 染色显示，与空白组比较，模型组主动脉窦处的病变面积增加（P＜0.05），提示造模成功； 与模型组比较，可定组、盾叶组主动脉窦处的病变面积减少（P＜0.05），但盾叶组抗主动脉窦斑块面积效果不如可定组（P＜0.05），见图1。

油红O 染色显示，空白组主动脉窦处仅见少量脂质蓄积； 与空白组比较，模型组主动脉窦处的脂质蓄积增加（P＜0.05）； 与模型组比较，可定组、盾叶组主动脉窦处的脂质蓄积减少，油红O 染色面积降低（P＜0.05），盾叶组与可定组无差异（P＞0.05），见图1。

胶原纤维的水平与斑块的稳定性密切相关。Masson 染色显示，与空白组比较，模型组主动脉窦斑块内胶原纤维减少（P＜0.05）； 与模型组比较，盾叶组主动脉窦斑块内胶原纤维增加（P＜0.05），见图1。

2.2 差异表达RNAs 通过高通量测序对9 例ApoE-/-小鼠主动脉组织样本的进行测序。得到363 个miRNAs、15 513个lncRNAs 和11 162 个mRNAs。经比对共发现1 623 个显著差异表达基因，其中与空白组比较，模型组共有602 个RNAs 表达下调，593 个RNAs 表达上调，总计1 195 个差异基因，分别为441 个lncRNAs、33 个miRNAs、721 个mRNAs。与模型组比较，盾叶组共有131 个RNAs 表达下调，391 个RNAs 表达上调，总计522 个差异基因，分别为275 个lncRNAs、3 个miRNAs、244 个mRNAs，见表1～2。

表1 差异表达RNAs 个数统计（个）

表2 差异表达RNAs 类型个数统计（个）

为验证差异表达结果的准确性，将全部1 623 个差异基因的表达进行聚类分析，结果显示不同组别的样本能完全区分开，见图2A。对组间差异表达的RNAs 进行GO 功能和KEGG 分析，可知模型组与空白组显著差异表达基因可富集到脂肪酸代谢（P＜0.001）、有机酸合成（P＜0.001）、PPAR 信号通路（P＜0.001） 等信号通路； 盾叶组与模型组显著差异表达基因可富集到与细胞外基质组织 （P＜0.001）、细胞骨架组织（P＜0.001）、血管平滑肌收缩（P＜0.001）、心律失常性右心室心肌病通路（P＜0.001） 等信号通路，见图2B。

2.3 构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA 调控网络 通过miRanda 本地化工具、starBase 资源及cor.test 函数计算对lncRNA、miRNA 和mRNA 之间的关系进行预测，共筛选得到96 对lncRNA-miRNA 连接、88 对miRNA-mRNA 连接、1 304对lncRNA-mRNA 连接，对连接关系进行整理并构建成共表达网络，见图3A。通过GO 功能和KEGG 分析可知，共表达部分可分别富集到转录调控（P＜0.001）、RNA 代谢过程的正调控（P＜0.001）、心律失常性右心室心肌病通路（P＜0.001） 等信号通路，见图3B。

2.4 WGCNA 及STEM 分析重叠基因 首先运用WGCNA 分析，为使网络接近无尺度分布，计算参数power 取值为1～30R2。如果模型R2越接近1，则模型越符合无尺度分布，一般情况下应R2≥0.8，本研究以0.9 为标准。当power＝24 时R2首次达到0.9，见图4A。剪枝高度设定为cutHeight ＝0.995，共筛选得到9 个相关模块，见图4B。计算每个模块与不同状态的关联性，共发现了4 个与样本状态显著正相关的模块，分别为green、blue、pink 和red，见图4C，其中green 包含124 个RNAs，blue 包含138 个RNAs，pink 包含93 个RNAs，red 包含123 个RNAs，总计478 个RNAs。

图4 WGCNA 分析图

其次利用STEM 对之前的1 623 个并集RNAs 进行表达变化趋势聚类，共得到了2 个显著的表达模式变化聚类，Cluster 1、2 分别包含了496、341 个RNAs （图5）。

图5 STEM 表达谱分析聚类图

最后比较WGCNA 算法获得的478 个RNAs 和STEM 分析中cluster 1、2 中包含的RNAs，分别有36、120 个重叠RNAs，见图6A。通过GO 功能和KEGG 分析可知，以上重叠RNAs 可分别富集到PPAR 信号通路（P＜0.001），脂质生物合成过程（P＜0.001），脂肪酸代谢过程（P＜0.001）等信号通路，见图6B。

图6 重复基因韦恩图（A） 及富集分析（B） 图

3 讨论

心脑血管疾病是人类首要致死因素，动脉粥样硬化是其主要病理基础［14］。中医学中并没有动脉粥样硬化病名，而是根据其临床症状将该病归属于“头痛” “眩晕” “中风” “胸痹” 等范畴。中医学认为本病的病机为本虚标实，气血阴阳亏虚为本，气滞、血瘀、痰湿为标。盾叶薯蓣俗称黄姜，以根状茎入药，其性味甘、苦、凉，具有清肺止咳、利湿通淋、解毒消肿和通经络等功效。盾叶冠心宁片的主要成分为盾叶薯蓣，具有活血化瘀、行气止痛、养血安神的功效。临床研究也表明盾叶冠心宁片治疗动脉粥样硬化效果显著，可减少临床心脑血管疾病发作数、调节血脂、降低同型半胱氨酸水平，但作用机制不明［15-17］。

载脂蛋白E （ApoE） 基因敲除小鼠因缺乏清除血浆中胆固醇的残粒的能力，所以可以在短期内通过高脂饲料喂养形成动脉粥样硬化模型［18］。本研究中为了探究盾叶冠心宁片抗动脉粥样硬化的机制，采用ApoE-/-小鼠作为模型，观察盾叶冠心宁片对动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠的作用，同时构建lncRNA-miRNA-mRNA 共表达网络并筛选其中的关键通路来探究其作用机制。病理结果表明，与模型组比较，盾叶组小鼠主动脉窦处粥样斑块面积减小，提示盾叶冠心宁片可减少小鼠主动脉壁内的斑块形成。据目前研究认为，减少斑块脂质核心的大小是稳定粥样硬化斑块的主要策略之一［19］。根据Masson 染色结果显示，与模型组比较，盾叶组小鼠斑块中胶原纤维水平增加，提示盾叶冠心宁片可增强斑块稳定性。本实验结果表明，盾叶冠心宁片具有减少动脉粥样硬化斑块形成的同时稳定斑块的作用。

研究发现miRNAs 和lncRNAs 在动脉粥样硬化的发病和发展中扮演重要角色。miRNAs 已经成为一些生理和病理生理过程的关键调节者，包括胆固醇外流、脂质代谢、平滑肌增殖、炎症反应。lncRNAs 被认为是一组新的表观遗传调控因子，调节巨噬细胞、脂质代谢、炎症和免疫反应［20］。本研究在既往研究基础上，通过构建lncRNAmiRNA-mRNA 调控网络对盾叶冠心宁片抗动脉粥样硬化的发病机制进行研究。动脉粥样硬化是一种脂蛋白驱动的疾病，脂质代谢障碍为其的病变基础。本研究发现，盾叶冠心宁片抗动脉粥样硬化的机制可能主要与脂质代谢有关，如脂肪酸代谢、脂质代谢过程、脂类生物合成、PPAR 信号通路。PPAR 信号通路参与胆固醇逆转运，可有效促进细胞排出过量的脂质，是正常机体维持脂代谢平衡的重要通路之一［21］，本研究结果与之一致。

综上所述，本研究中构建的盾叶冠心宁片抗动脉粥样硬化相关的lncRNA-miRNA-mRNA 共表达网络为后续更深入研究动脉粥样硬化的关键基因及基因间的调控关系提供了参考和方向。然而本研究未对网络中的调控关系进行验证，将在后续研究中进一步分析并予以证实。