李 红，陈金锐，杨智源

（1.长春医学高等专科学校口腔教研室，吉林 长春 130031； 2.长春医学高等专科学校临床医学院，吉林 长春 130031）

口腔癌为头颈部恶性肿瘤，吸烟、饮酒、局部刺激、饮食习惯、营养不良和病毒感染等均是诱发口腔癌的重要因素［1］。手术是治疗口腔癌的最有效手段，但由于其发病隐匿，多数患者在确诊时即为中、晚期，错过了手术治疗的最佳机会； 同时，口腔癌对多种传统化疗药物不敏感，从而给其治疗带来诸多不利［2］。口腔癌细胞异常增殖与周期进程及凋亡受阻有关，利用细胞周期阻滞及诱导凋亡来抑制肿瘤细胞增殖是现今抗肿瘤药物探究的热点［3-4］。

蛇床子素是从中药蛇床子CnidiummonnerL.Cusson 干燥果实中分离出来的具有香豆素结构的天然活性产物，其化学名为7-甲氧基-8-异戊烯基香豆素。蛇床子素具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、免疫调节和神经保护等多种药理作用［5］。此外，研究显示蛇床子素对卵巢癌SKOV3 细胞［6］、宫颈癌Hela-S3 细胞［7］及胆管癌QBC939 细胞［8］的增殖均有抑制作用，然而蛇床子素对口腔癌的抑制作用及机制研究未见报道。因此，本研究以口腔癌KB 细胞为研究对象，探讨蛇床子素对其增殖的影响，并阐明该作用与细胞周期进程及凋亡的关联，旨在为蛇床子素用于口腔癌的治疗提供依据。

1 材料

1.1 细胞株 口腔癌KB 细胞株，购于中国科学院上海细胞库，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下，用含10%胎牛血清和RPMI-1640 培养液进行常规传代及培养，于本实验室传代保存。

1.2 药物与试剂 蛇床子素（纯度97%，批号20190215，成都普瑞法科技开发有限公司）。胎牛血清（美国Gibco 公司）； 细胞计数试剂盒8 （CCK-8）、RPMI-1640 培养液（美国Amresco 公司）； 碘化丙啶（PI） 单染试剂盒及膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/PI （Annexin V-FITC/PI） 双染试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）； TRIzol、逆转录试剂盒（日本TaKaRa 公司）； 实时定量PCR 试剂盒（美国Thermo 公司）； Hoechst 33258 染色试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司）； 半胱氨酸蛋白酶-3 （ caspase-3）、caspase-8、caspase-9 活性酶联免疫吸附测定法（ELISA） 检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）； 兔源Janus 激酶2（JAK2）、磷酸化JAK2 （p-JAK2）、信号转导和转录激活因子3 （STAT3）、磷酸化STAT3 （p-STAT3） 多克隆抗体（英国Abcam 公司）； 山羊抗兔IgG 二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.3 仪器 IR 型CO2培养箱（上海丙林电子科技有限公司）； Sunrise-Basci 酶标仪（瑞士Tecan 公司）； IMT-2 型显微镜（日本Olympus 公司）； FACS Calibur 流式细胞仪（美国BD 公司）； U-T6 紫外分光光度计［屹谱仪器制造（上海） 有限公司］； Applied Biosystems PCR 仪（美国Thermo公司）； DYCZ-30C 型蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 CCK-8 法检测细胞增殖 取对数生长期KB 细胞，调整密度为1×105/mL，接种至96 孔板，每孔100 μL，培养24 h 至细胞贴壁后，分别加入含0、10、20、40、80、160 μg/mL 蛇床子素的完全培养液，继续培养24、48、72 h后，加入CCK-8 试剂10 μL，继续孵育5 h，在450 nm 波长处检测吸光度（A） 值，计算细胞增殖抑制率。

2.2 流式细胞术检测细胞周期进程及细胞凋亡率 取对数生长期KB 细胞，调整密度为1×105/mL，接种至24 孔板，每孔500 μL，培养24 h 至细胞贴壁后，分别加入含0、40、80、160 μg/mL 蛇床子素的完全培养液，继续培养48 h 后收集细胞，采用PI 单染试剂盒检测细胞周期进程，使用CXP 分析软件进行分析并记录； 通过Annexin V FITC/PI 双染试剂盒检测细胞凋亡率。

2.3 RT-qPCR 法检测细胞c-myc、cyclinA、cyclinD1 mRNA 表达 细胞按“2.3” 项下方法分组及处理，收集各组细胞，PBS 漂洗后采用TRIzol 法提取总RNA，并通过紫外分光光度计检测其浓度及纯度，采用逆转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA，PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。反应体系为20 μL，反应条件为95 ℃变性3 min、95 ℃10 s、60 ℃退火30 s、70 ℃延伸30 s，共35 次循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法分析c-myc、cyclinA、cyclinD1 mRNA 相对表达。

表1 引物序列

2.4 Hoechst 33258 染色观察细胞凋亡形态 细胞按“2.3” 项下方法分组及处理，参照Hoechst 33258 染色试剂盒说明书，经固定、洗涤、制片、染色等步骤，于显微镜下观察各组细胞凋亡形态并拍照记录。

2.5 ELISA 法检测细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9 活性 细胞按“2.3” 项下方法分组及处理，收集各组细胞，PBS 漂洗后，加入100 μL 裂解液，在冰水浴中放置10 min，充分裂解细胞，分别加入二硫苏糖醇50 μL 及荧光标记底物5 μL，37 ℃充分反应90 min，在450 nm 波长处检测A值，计算细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9 相对活性。

2.6 Western blot 法检测细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达 细胞按“2.3” 项下方法分组及处理，收集各组细胞，PBS 漂洗后，加入适量的裂解液裂解细胞，提取总蛋白，通过BCA 法测定蛋白浓度，蛋白样品煮沸变性。采用SDSPAGE 电泳分离蛋白，并转至PVDF 膜，加5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，TBST 洗膜后加入JAK2 （1 ∶2 000）、p-JAK2（1 ∶2 000）、STAT3 （1 ∶2 000） 和p-STAT3 （1 ∶2 000）抗体，4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜后再加入相应的二抗（1 ∶5 000），室温下避光孵育2 h，加底物后显色，通过Quantity One 软件进行灰度分析，计算蛋白相对表达量。

2.7 统计学分析 通过SPSS 22.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 蛇床子素对口腔癌KB 细胞增殖的影响 经10、20、40、80、160 μg/mL 蛇床子素作用口腔癌KB 细胞24、48、72 h 后，与对照组（0 μg/mL） 比较，10、20 μg/mL 蛇床子素组细胞在各时间点增殖抑制率均无明显变化 （P＞0.05），而40、80、160 μg/mL 蛇床子素组细胞在各时间点增殖抑制率均升高（P＜0.05，P＜0.01），见图1。结果表明，蛇床子素对口腔癌KB 细胞的增殖具有抑制作用，且该作用具有剂量及时间依赖性。

3.2 蛇床子素对口腔癌KB 细胞周期进程的影响 与对照组（0 μg/mL） 比较，40、80、160 μg/mL 蛇床子素组G0/G1细胞比例增加（P＜0.05，P＜0.01），见图2。结果表明，蛇床子素可以影响口腔癌KB 细胞周期进程，主要表现为使G0/G1期细胞阻滞。

图2 蛇床子素对口腔癌KB 细胞周期进程的影响（±s，n＝3）

3.3 蛇床子素对口腔癌KB 细胞c-myc、cyclinA、cyclinD1 mRNA 表达的影响 与对照组（0 μg/mL） 比较，40、80、160 μg/mL 蛇床子素组细胞c-myc、cyclinA、cyclinD1 mRNA 表达均降低（P＜0.05，P＜0.01），见图3。

图3 蛇床子素对口腔癌KB 细胞c-myc、cyclin A、cyclin D1 mRNA 表达的影响（±s，n＝3）

3.4 蛇床子素对口腔癌KB 细胞凋亡的影响 对照组细胞核染色质未见明显浓缩，细胞核轮廓清晰可见； 40、80、160 μg/mL 蛇床子素组细胞核染色质浓缩现象明显，细胞核染色呈亮白色，尤以160 μg/mL 蛇床子素组效果最突出，见图4。与对照组（0 μg/mL） 比较，40、80、160 μg/mL蛇床子素组细胞凋亡率均升高（P＜0.01），见图5。以上结果表明，蛇床子素具有诱导口腔癌KB 细胞凋亡的作用。

图4 各组细胞Hoechst 33258 染色（×400）

图5 蛇床子素对口腔癌KB 细胞凋亡率的影响（±s，n＝3）

3.5 蛇床子素对口腔癌KB 细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9 活性的影响 与对照组（0 μg/mL） 比较，40、80、160 μg/mL 蛇床子素组细胞caspase-3、caspase-8、caspase-9 活性均升高（P＜0.05，P＜0.01），见图6。进一步在分子水平上提示蛇床子素具有诱导口腔癌KB 细胞凋亡的作用。

3.6 蛇床子素对口腔癌KB 细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达的影响 与对照组 （0 μg/mL） 比较，40、80、160 μg/mL蛇床子素组细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达均降低（P＜0.05，P＜0.01），见图7。结果提示，蛇床子素具有抑制口腔癌KB 细胞JAK2/STAT3 信号通路活化的作用。

图7 蛇床子素对口腔癌KB 细胞p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达的影响（±s，n＝3）

4 讨论

肿瘤细胞的快速增殖与细胞周期进程受阻有关，调控肿瘤细胞周期，促进其凋亡是目前肿瘤治疗的主要研究方向［9-10］。细胞周期一般分为G0、G1、S、G2和M 期，主要受c-myc、cyclinA、cyclinD1 等基因调控［11-12］。本研究结果显示，与对照组比较，不同质量浓度蛇床子素作用于口腔癌KB 细胞48 h 后，G0/G1细胞比例增加，且c-myc、cyclin A、cyclinD1 mRNA 表达降低，表明蛇床子素具有促进细胞周期进程阻滞的作用。细胞周期进程被阻滞后，不能够被及时修复的细胞则会发生凋亡［13］。凋亡是通过激活内在自杀机制而诱发的细胞程序性死亡过程，caspase-3、caspase-8、caspase-9 是凋亡过程中的关键执行分子，许多天然产物对肿瘤细胞增殖的抑制作用均与诱导凋亡有关［14-15］。本研究结果显示，40、80、160 μg/mL 蛇床子素作用于口腔癌KB 细胞48 h 后，呈现出明显的凋亡形态，凋亡率及caspase-3、caspase-8、caspase-9 活性增加，表明蛇床子素具有促进细胞凋亡的作用。

调控肿瘤相关信号通路的活化，是蛇床子素发挥抗肿瘤作用的重要机制。Che 等［16］研究发现，蛇床子素可以通过抑制ATM/NF-κB 信号通路活化增强子宫颈癌细胞的抗肿瘤活性和辐射敏感性。Ding 等［17］研究表明，蛇床子素能够通过抑制PI3K/Akt 和MAPK 信号通路的活化在大鼠胶质瘤细胞中表现出抗癌特性。JAK2/STAT3 信号通路在细胞增殖、周期进程及凋亡等生理过程中均发挥重要作用，是近年来备受关注的一条信号通路，其异常活化可导致正常细胞出现异常增殖甚至恶变，在人类主要的恶性肿瘤中基本都存在异常的高表达［18-19］。研究发现，多种中药单体可通过调节JAK2/STAT3 信号途径抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞周期进程阻滞及凋亡［20-21］。本研究结果表明，40、80、160 μg/mL 蛇床子素作用于口腔癌KB 细胞48 h后，p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达均降低，提示抑制JAK2/STAT3 信号通路的活化是蛇床子素抑制口腔癌KB 细胞增殖、促进细胞周期进程阻滞及凋亡的潜在机制。