谢建寰，李冬春，刘春凤，肖小斌

（1.江西省赣州市中医院，江西 赣州 341000； 2.江西省井冈山市笫二人民医院，江西 井冈山 343600）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 指的是由酒精及已知的能够导致肝损伤的确定因子之外的其他因子引起的临床综合病症。NAFLD 是一种分布范围较为广泛的慢性疾病，包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化，甚至可能发展为肝癌，对人类生命健康造成了极大的困扰［1-2］。NAFLD 发病率较高，全球发病人口占总人口的25%［3-4］。其发病机制涉及氧化应激反应、脂质代谢、炎症反应等，较为复杂，目前临床对于NAFLD 患者的治疗大多只能从生活方式进行干预，而缺乏有效治疗药物，由此可见，研究NAFLD 的有效治疗方案或药物是当今时代的迫切要求。人参皂苷Rg1 为五加科植物人参以及三七中的有效活性成分，研究发现其药理作用广泛，具有抗炎症、抗纤维化、保护神经、抗肿瘤、保护心血管等作用［5-7］。研究发现，人参皂苷Rg1 对脂肪肝内的脂肪堆积具有明显的改善作用［8］。本研究主要探究人参皂苷Rg1 对非酒精性脂肪肝大鼠的干预作用，并从肝细胞凋亡、脂肪代谢、炎症反应3 个方面对其作用机制作进一步分析。

1 材料

1.1 动物 102 只SPF 级健康成年雄性SD 大鼠，体质量（200±20） g，购自成都达硕生物科技有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （川） 2015-030，实验动物使用许可证号SYXK （川） 2014-189］，适应性喂养2 周后用于实验。本次实验符合医学伦理学要求。

1.2 药物与试剂 人参皂苷Rg1 （货号G909436，纯度≥98%，上海麦克林生化科技股份有限公司）。普通饲料（货号CS-102，辽宁长生生物技术股份有限公司）； 二甲双胍（批号wkq-02823，四川省维克奇生物科技有限公司）； 高脂饲料（83%基础饲料+2%胆固醇+10%猪油+5%蔗糖，货号XTHF60，江苏省协同医药生物工程有限责任公司）； 肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、白细胞介素-6 （IL-6）、白细胞介素-1β （IL-1β） 检测试剂盒 （货号H052、H007、H002，南京建成生物工程研究所）； 兔源CAT1、CoASH1、ACOX1、Bcl-2、Bax、caspase-3、β-actin 一抗、山羊抗兔lgG 二抗（货号ab37588、ab129012、ab184032、ab182858、ab32503、ab32351、ab8226、ab205718，英国Abcam 公司）。

2 方法

2.1 造模与分组 102 只大鼠随机分为5 组，分别为正常组、模型组、二甲双胍组（阳性对照） 及人参皂苷低、高剂量组，正常组和模型组每组21 只，其余组每组20 只。正常组给予普通饲料，其余组大鼠均给予高脂饲料，共喂养12 周。于12 周末，正常组和模型组分别随机选1 只大鼠，取肝脏进行苏木精-伊红（HE） 染色，观察是否造模成功，造模成功的标准为大鼠肝组织有大量脂肪空泡。造模成功后给药干预，正常组和模型组灌胃给予20 mL/kg 生理盐水，人参皂苷低、高剂量组灌胃给予20、40 mg/kg 人参皂苷Rg1［9］，二甲双胍组灌胃给予20 mg/kg 二甲双胍，连续8 周。

2.2 样本采集 给药结束后，大鼠禁食12 h，经水合氯醛麻醉，心脏取血，处死后取肝脏。全血3 000 r/min 离心15 min，取上层血清，将血清及肝脏置于-80 ℃下保存备用。

2.3 大鼠血清肝功能、脂质及炎症因子水平检测 取大鼠血清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清肝功能指标谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT） 水平，以及血脂指标甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C） 水平。采用酶联免疫试剂盒，按照说明书要求检测大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

2.4 大鼠肝组织细胞凋亡、脂肪酸β 氧化相关蛋白表达检测 取大鼠部分肝组织，根据BCA 蛋白试剂盒说明书提取总蛋白。蛋白样品经SDS-PAGE 凝胶电泳，湿法将蛋白质转移至PVDF 膜上，用5%脱脂奶粉溶液在室温下封闭1 h，洗膜后加入 Bcl-2、Bax、caspase-3、CAT1、CoASH1、ACOX1、β-actin 一抗（1 ∶1 000） 4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗lgG （1 ∶5 000） 室温孵育1 h，曝光显影，根据目的蛋白与内参蛋白灰度值比值计算目的蛋白相对表达量。

2.5 大鼠肝组织病理及细胞凋亡检测 取大鼠肝组织，用10%甲醛进行固定3 d，石蜡包埋，常规切片（5 μm），脱蜡水化后分别进行HE、TUNEL 染色，显微镜下观察组织病理形态及细胞凋亡情况。

2.6 统计学分析 通过SPSS 20.0 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 人参皂苷Rg1 对大鼠血清肝功能的影响 如表1 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清AST、ALT 水平均升高（P＜0.05）； 与模型组比较，人参皂苷Rg1 各剂量组和二甲双胍组大鼠血清AST、ALT 水平均降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血清AST、ALT 水平比较（IU/L，±s，n＝20）

表1 各组大鼠血清AST、ALT 水平比较（IU/L，±s，n＝20）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别ASTALT正常组36.46±4.29128.90±23.09模型组69.12±2.09*206.16±39.40*人参皂苷Rg1 低剂量组45.31±2.46＃149.82±29.05＃人参皂苷Rg1 高剂量组42.71±2.69＃157.47±27.80＃二甲双胍组43.22±2.51＃154.39±28.07＃

3.2 人参皂苷Rg1 对大鼠血清脂质水平的影响 如表2 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平均升高（P＜0.05）； 与模型组比较，人参皂苷Rg1 低剂量组和二甲双胍组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平均降低（P＜0.05），人参皂苷Rg1 高剂量组大鼠血清TG、TC 水平均降低（P＜0.05），HDL-C、LDL-C 水平无明显变化（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平比较（mmol/L，±s，n＝20）

表2 各组大鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C 水平比较（mmol/L，±s，n＝20）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别TGTCHDL-CLDL-C正常组0.46±0.192.05±0.371.52±0.190.26±0.08模型组1.05±0.24*4.32±0.40*3.06±0.17*0.51±0.08*人参皂苷Rg1 低剂量组0.73±0.20＃3.61±0.33＃2.93±0.11＃0.41±0.15＃人参皂苷Rg1 高剂量组0.76±0.23＃3.62±0.29＃2.95±0.220.48±0.09二甲双胍组0.75±0.21＃3.61±0.30＃2.94±0.19＃0.45±0.11＃

3.3 人参皂苷Rg1 对大鼠血清炎症因子水平的影响 如表3 所示，与正常组比较，模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均升高（P＜0.05）； 与模型组比较，人参皂苷Rg1各剂量组和二甲双胍组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比较（ng/mL，±s，n＝20）

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β 水平比较（ng/mL，±s，n＝20）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别TNF-αIL-6IL-1β正常组1.35±0.230.17±0.080.22±0.06模型组4.87±0.25* 0.48±0.10* 0.53±0.11*人参皂苷Rg1 低剂量组 3.06±0.27＃0.31±0.08＃ 0.39±0.13＃人参皂苷Rg1 高剂量组 2.90±0.37＃0.30±0.12＃ 0.41±0.17＃二甲双胍组2.99±0.30＃0.30±0.09＃ 0.40±0.15＃

3.4 人参皂苷Rg1 对大鼠肝组织细胞凋亡相关蛋白表达的影响 如表4、图1 所示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织Bax、caspase-3 蛋白表达均升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.05）； 与模型组比较，人参皂苷Rg1 各剂量组和二甲双胍组大鼠肝组织Bax、caspase-3 蛋白表达均降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白表达均升高（P＜0.05）。

图1 各组大鼠肝组织Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白条带图

表4 各组大鼠肝组织Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表达比较（±s，n＝20）

表4 各组大鼠肝组织Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表达比较（±s，n＝20）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别Bcl-2Baxcaspase-3正常组1.05±0.050.47±0.060.27±0.04模型组0.35±0.03* 0.98±0.04* 1.04±0.04*人参皂苷Rg1 低剂量组 0.70±0.05＃0.67±0.04＃ 0.51±0.03＃人参皂苷Rg1 高剂量组 0.71±0.03＃0.63±0.08＃ 0.50±0.04＃二甲双胍组0.70±0.06＃0.64±0.06＃ 0.50±0.03＃

3.5 人参皂苷Rg1 对大鼠肝组织脂肪酸β 氧化相关蛋白酶表达的影响 如表5、图2 所示，与正常组比较，模型组大鼠肝组织 CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表达均降低（P＜0.05）； 与模型组比较，人参皂苷Rg1 各剂量组和二甲双胍组大鼠肝组织CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表达均升高（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肝组织CAT1、CoASH1、ACOX1蛋白条带图

表5 各组大鼠肝组织CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表达比较（±s，n＝20）

表5 各组大鼠肝组织CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表达比较（±s，n＝20）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别CAT1CoASH1ACOX1正常组1.23±0.071.19±0.07 1.21±0.09模型组0.33±0.05* 0.29±0.08* 0.33±0.06*人参皂苷Rg1 低剂量组 0.88±0.07＃ 0.86±0.09＃ 0.92±0.04＃人参皂苷Rg1 高剂量组 0.86±0.05＃ 0.87±0.08＃ 0.88±0.06＃二甲双胍组0.87±0.06＃ 0.86±0.08＃ 0.90±0.05＃

3.6 人参皂苷Rg1 对大鼠肝组织病理形态的影响 如图3所示，正常组肝细胞排列整齐、形态正常，未见明显的细胞变性、坏死，无大型脂肪空泡、炎性细胞浸润； 模型组肝细胞排列混乱，可见大量细胞坏死，存在大量脂肪空泡及炎性细胞浸润； 而人参皂苷Rg1 各剂量组和二甲双胍组肝细胞形态趋向正常，脂肪空泡、炎性细胞浸润情况均有不同程度的改善。

图3 各组大鼠肝组织HE 染色（×400）

3.7 人参皂苷Rg1 对大鼠肝组织凋亡的影响 如图4、表6 所示，棕黄色细胞为阳性凋亡的细胞，正常组大鼠肝组织几乎未见凋亡细胞； 模型组大鼠肝组织凋亡细胞明显增多，且细胞凋亡率升高（P＜0.05）； 人参皂苷Rg1 各剂量组和二甲双胍组肝组织凋亡细胞均有不同程度的减少，且细胞凋亡率降低（P＜0.05）。

图4 各组大鼠肝组织TUNEL 染色（×400）

表6 各组大鼠肝组织细胞凋亡率比较（±s，n＝20）

注： 与正常组比较，*P＜0.05； 与模型组比较，＃P＜0.05。

组别凋亡率/%正常组9.01±2.58模型组77.27±4.01*人参皂苷Rg1 低剂量组62.12±3.90＃人参皂苷Rg1 高剂量组40.07±3.54＃二甲双胍组45.04±3.70＃

4 讨论

早期专家认为，NAFLD 的治疗主要依靠生活方式的改变，但研究显示生活方式的干预并不能逆转肝细胞损伤［10］，因此对于NAFLD 药物治疗方面的研究是必不可少。本研究通过探讨人参皂苷Rg1 对NAFLD 大鼠的干预作用，并从肝细胞凋亡、脂肪代谢、炎症反应3 个方面初步解释其作用机制。

细胞凋亡是一种自然的程序性死亡过程。介导细胞凋亡的途径主要有线粒体途径、内质网途径和死亡受体途径。在线粒体途径中，氧化应激诱导的线粒体损伤导致细胞色素C 释放到细胞质中，诱导细胞凋亡是一个关键途径。在线粒体凋亡途径中，Bcl-2 蛋白具有抗凋亡作用，Bax 蛋白具有促凋亡作用，在线粒体凋亡途径中发挥关键作用。caspase-3 作为多种凋亡途径中常见的下游作用部分，其底物多为细胞内的功能蛋白，与DNA 修复、mRNA 切割、细胞骨架重建等相关。在正常情况下，caspase-3 作为一种无活性的前酶存在； 当受到内部或外部因素的刺激时，caspase-3 被激活。激活caspase-3 可诱导细胞凋亡的发生，并在细胞凋亡的早期阶段启动和执行。此外，研究发现肝脏内脂肪过度堆积会引起脂肪过氧化损伤及氧化应激损伤，导致肝细胞凋亡激活肝星状细胞的活化，进而促进肝纤维化、炎症反应等，进一步加剧NAFLD 的发展进程［11-13］。徐雅姝等［14］研究发现，人参皂苷Rg1 可能通过抑制氧化应激反应减轻细胞凋亡，进而对NAFLD 起到明显改善作用。NAFLD 发病的首要病因为肝脏脂肪过度堆积，脂肪酸β-氧化是人体内脂质代谢的主要信号通路之一，正常条件下的脂肪酸进入肝脏后可经β-氧化分解后为人体提供能量，但NAFLD 患者体内脂肪酸β-氧化途径无法分解过量的脂肪酸，导致其在肝脏内堆积，还会进一步负反馈调节抑制β-氧化途径相关酶的表达，形成恶性循环，使病情持续加重［15］。高月等［16］研究发现，人参皂苷Rg1 能够降低脂质形成、加速脂质代谢，从而抑制肝细胞的脂肪堆积。有学者认为炎症反应导致肝细胞损伤是NAFLD 发病的“二次打击”［17］，因此炎症反应也是影响NAFLD 病情发展的重要机制之一。

二甲双胍善具有调节血脂、降低体质量等作用，本研究表明人参皂苷Rg1 调节血脂的作用与二甲双胍相当。与模型组比较，各给药组大鼠肝功能指标、血脂和炎症因子水平降低，Bax、caspase-3 蛋白表达下调，Bcl-2、CAT1、CoASH1、ACOX1 蛋白表达上调，肝组织损伤得到改善，表明人参皂苷Rg1 能缓解肝损伤，降低血脂、炎症水平，减少凋亡表达，促进脂肪酸β-氧化，与文献报道相吻合。但由于本次实验样本量过少，实验结果可能存在局限性，未来可扩大样本量或通过临床疗效作进一步分析。

综上所述，人参皂苷Rg1 可能通过抑制肝细胞凋亡、促进脂肪分解、抑制炎症反应抑制NAFLD 疾病的发展。